电针对脑缺血再灌注小鼠脑组织NOX2/gp91phox表达的影响

曾 超，陈 静，刘文兵，李 辉，王 静，马睿杰

(浙江中医药大学附属第三医院·浙江 杭州 310012)

目前已经明确，溶栓治疗性血管再通及自然再通(血管侧枝建立)的再灌注后，产生严重的缺血性再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[1-2]。损伤机制主要为活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和自由基的大量产生，使得超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等酶的清除能力有限[3-4]。针灸治疗在脑血管疾病治疗方面应用广泛，其机制研究目前均致力于针刺干预对脑血管疾病氧化反应的某些环节，清除已经形成的氧化物质，对氧化反应上游靶点的研究及调节通路研究甚少。本研究从ROS产生的主要来源，氧化应激的上游靶点即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate 0xidase，NOX)，如何参与脑损伤的发生以及其对神经元的作用机制角度进行研究，其中NOX催化亚单位NOX2/gp91phox与缺血性脑卒中等神经系统疾病密切相关[5-6]；并采用敲除此基因片段的小鼠作为阳性对照组，从更相似更平行的机理角度去揭示电针的抗氧化机制，运用生物科技手段开创针刺治疗脑血管疾病的一个崭新研究领域。

1 材料与方法

1.1 动物、模型制备及分组 健康雄性7～9周龄C57/BL6野生型小鼠120只，体质量(25.30±2.50)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(沪)2013-0016。gp91phox基因敲除组(以下文简称基因组)小鼠30只，体质量(23.40±2.02)g，购于南京大学模式动物研究。120 只C57/BL6小鼠和30 只基因敲除小鼠均按照经典的Zea-Longa改良线栓法[7]制备小鼠I/R模型。动物成模后按体质量编号后随机分为：3、24、48 h 3个大组(基因组用特殊的记号笔标识)，每个大组又分为模型组、电针组、药物组、基因组4个小组，每组10只，另按各时间点设假手术组，每组10 只。

1.2 药物、试剂与仪器 夹竹桃麻素(Apocynin)：浙江常青化工有限公司。二甲亚砜(DMSO)：浙江常青化工有限公司；电泳级琼脂糖：上海东海制药厂；NADPH试剂盒：Sigma-Aldrich；光泽精： Sigma-Aldrich。PeriFlux 5000激光多普勒组织血流检测仪器：瑞典百灵威中国公司；HANS-200E韩氏穴位神经刺激仪：北京华卫产业开发公司；华佗牌15 mm毫针：苏州医疗用品厂有限公司；CFX96 PCR仪：美国伯乐；TG16-WS高速离心机：湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 干预方法 假手术组：给予相同的抓取处理，不造模；模型组给予I/R造模；基因组：I/R造模；药物组：选用NOX特异性抑制剂 Apocynin 溶于DMSO，按 50 mg /kg剂量于再灌注后3、24、48 h行腹腔注射[8]，注射结束即用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主动脉放血，剪下大脑，置于冰台上快速取出右侧大脑组织，于-80 ℃冰箱中备用；电针组：将小鼠用鼠带捆绑束缚，但不影响小鼠的正常生命活动为度，再灌注3、24、48 h将15 mm毫针刺入督脉腧穴“百会”“大椎”(穴位定位参照华兴邦[9]所作“大鼠定位图谱的研制”)，刺入穴位后，接韩氏电针仪，输出电流1～3 mA，以小鼠安静耐受、针体轻轻抖动为宜，频率15 Hz，连续波，时间30 min；留针时间结束后，取脑组织，方法同药物组方法。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能缺损评分 参照Zea-Longa的评分方法[10]，I/R模型完成(即再灌注)即刻、再灌注后3、24、48 h(干预后)观察并记录神经功能缺损评分。无神经病学征象为0分；提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直为1分；向瘫痪侧旋转征象为2分；向病灶对侧跌倒为3分；无自发活动及意识障碍为4分。

1.4.2 rCBF检测 采用激光多普勒组织血流仪检测[11]。具体方法：在大脑右侧的眼角和外耳道中间(大脑中动脉区域)分离肌肉暴露颅骨，运用自制的简易探头黏贴于骨面上，将激光多普勒探针插入探头内便可以进行微血管血流的测控，分别观察并记录小鼠缺血前、缺血即刻(达到缺血前30%即认为造模成功[12])，再灌注即刻和再灌注后3、24、48 h各时相的脑血流值，每个时相值均维持平稳后3 min左右。

1.4.3 光泽精增强发光法检测NOX活性 脑组织匀浆并离心，取上清液测定蛋白质浓度，NADPH氧化酶的测定要加入其作用底物NADPH(10-4mol/L)和光泽精(5×10-6mol/L)，当加入含有25～50 μg蛋白的组织上清液10～20 μL后反应开始，酶活性以每毫克蛋白每分钟的毫摩尔数表示[13]。

1.4.4 半定量PCR(RT-PCR)法检测NOX2/gp91phox表达 大脑总mRNA提取按文献方法[14]进行，PCR上、下游引物通过网站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物设计程序(primer 3.0)设计。PCR 扩增：NOX2/gp91phox反应条件为95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，53.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循环28 次，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。上述PCR 产物用2% 琼脂糖凝胶电泳。凝胶在紫外灯下观察，即时成像相机拍照。利用计算机辅助的图像分析仪扫描，进行定量分析。

2 结果

2.1 电针对I/R小鼠神经行为学的影响 见表1。

表1 各组小鼠脑缺血再灌注不同时间点神经功能缺损评分比较分)

2.2 电针对I/R小鼠脑血流的影响 见表2。

表2 各组小鼠脑缺血再灌注不同时间点脑血流值测定结果比较

2.3 电针对I/R小鼠脑组织NOX活性的影响 见表3。

表3 各组小鼠脑组织不同时间点NOX活性的比较

2.4 电针对I/R小鼠脑组织NOX2/gp91phox表达的影响 见图1，表4。

图1 各组小鼠脑组织不同时间点NOX2/gp91phox表达的RT-PCR检测结果

表4 各组小鼠脑缺血再灌注不同时间点脑组织NOX2/gp91phox表达的比较

3 讨论

脑缺血性损伤的病理生理机制非常复杂, 其中脑细胞能量代谢障碍与代谢性酸中毒、炎症反应及自由基损伤是其重要的损伤机制[15]。NOX是ROS产生的主要来源，NADPH 氧化酶是由 p40phox、p47phox、p67phox、p22phox和 gp91phox(即NOX2)等 5 个亚基组成的膜结合蛋白[5-6]。其同源物主要包括 NOX2，NOX1，NOX3，NOX4 和 NOX5。 gp91phox和p22phox亚基位于质膜上，p47phox，p67phox，p40phox和Rac亚基位于胞浆内。gp91phox是其主要的功能亚基即催化亚基，p22phox的C末端有一富含脯氨酸的尾巴。吞噬细胞中的NOX通常是静止的，当受到某些胞外因素的刺激时，胞浆中的p47phox，p67phox，p40phox和Rac通过p22phox上富含脯氨酸的尾巴与之结合形成酶复合体，这种结合能够使gp91phox活化，从而发挥生物学作用[16]。研究已经证实，NOX催化亚单位gp91phox与缺血性脑卒中等神经系统疾病密切相关[17-18]，gp9lphox基因敲除小鼠的缺血性血脑屏障损伤、脑梗死面积均比野生型小鼠显著地减轻[19-20]，表明NOX2在缺血性血脑屏障损伤中有重要作用，抑制NOX的产生成为I/R后抗氧化治疗的主要靶点。

Apocynin 又名加拿大麻素、罗布麻宁，是一种天然存在的甲氧基被取代的邻苯二酚，分子量为 166.17 道尔顿。被用作中草药治疗炎症和特定的感染性疾病已经有几百年历史。近来研究证明 Apocynin 是一种常用的NOX高选择性抑制剂，它能有效地抑制NOX亚单位的结合[21]。但是有研究发现，Apocynin在吞噬细胞中以二聚体形式抑制NOX的作用，而在非吞噬细胞(如血管内皮或平滑肌细胞)中则不具有抑制NOX的作用，在体外试验中甚至有刺激活性氧生成的作用[22]。Castor等[23]认为，高剂量的罗布麻宁可能具有促氧化作用，较窄的治疗剂量范围会使其使用受到限制。由于药物的剂量选择及特异性，因此临床应用范围比较局限，有待进一步研究。然而电针的安全性及实用性却已经被广泛运用于临床治疗脑损伤类疾患[24-25]。

本研究发现I/R后小鼠脑组织NOX活性增强，干预各组其活性比模型组均明显下降，灌注后各时段，药物组和电针组NOX活性均比模型组下降，电针组和药物组比较无明显差异。I/R后小鼠脑组织NOX2/gp9lphox基因表达增强，干预各组的基因表达均比模型组明显下降，灌注后各时段，药物组和电针组NOX2/gp9lphox基因表达均比模型组下降，电针组和药物组比较无明显差异。表明药物和电针干预对I/R后小鼠脑组织NOX的活性和NOX2/gp9lphox基因表达有一定的抑制作用，电针可以达到药物的相似作用；因此可以推断电针亦可通过抗氧化应激的作用，阻止I/R造成的损伤，并且其保护作用至少部分是通过对NOX活性的抑制作用而产生。

本研究发现小鼠I/R后脑组织NOX活性及NOX2的表达均迅速增高，电针对急性I/R后氧化应激反应的影响因介入时间的不同而存在一定差异。实验结果提示越早干预其下降越明显，R3 h电针组疗效强于R24h、R48 h电针组。提示临床治疗I/R损伤应注意针刺时机的选择，I/R后应尽早开始电针治疗，能够获得最大的收益，最大幅度的调节氧化应激的反应。

脑缺血再灌注损伤相当于祖国医学的“中风”，历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说，故本实验针刺选穴以督脉经为主。百会穴为督脉经穴，亦是督脉、足太阳膀胱经、手少阳三焦经、足少阳胆经、足厥阴肝经五条经脉的交会穴，居一身之最高，刺之有通阳启闭、醒脑利水之功。大椎穴在第七颈椎棘突下，位近于脑部，是手足三阳、督脉的交会穴。“此穴是督脉之结，统乎三阳而助卫气”(《古法新解·会元针灸学》)，协调阳气之总纲。因此两穴相配共奏醒脑开窍、回阳救逆之功。

本研究从新角度深入地探讨针刺抗氧化作用的分子学机制，解释针刺治疗脑血管疾病的原理，为进一步研究非药物抗氧化疗法开辟了新途径，为临床上治疗脑血管疾病提供新的实验研究基础，为防治脑血管疾病展示更广阔的应用前景。