头部运动区电针刺激对脑瘫大鼠脑神经细胞自噬的调控作用

高 晶，梅润宏，何璐娜，周桂超，王莉娜，于雪峰

(1江苏省淮安市妇幼保健院·江苏 淮安 223002；2南昌大学第四附属医院·江西 南昌 330003)

脑瘫(cerebral palsy，CP)是儿童神经系统疾病中致残率极高的疑难病和多发病，严重危害儿童的身心健康。促进脑瘫神经功能康复效果及作用机制研究，仍是当前世界医学界研究的一大热点[1]。在治疗脑瘫的众多方法中，电针刺激头部运动区疗法，因更具有简便易行、疗效显著、安全可靠等优点，已得到众多学者及临床医生的认可，但其作用机制研究尚少，缺乏评估治疗效果的科学依据[2-3]。最新研究证明：新生儿CP模型的主要病理改变是大脑皮层的缺血缺氧性损害，显示出3种形态上不同的细胞死亡，即细胞凋亡、坏死和自噬[4]。本文对电针刺激头部运动区调控神经细胞自噬，促进脑瘫神经功能康复的观察效果做如下报道。

1 材料

健康7日龄健康SD大鼠，清洁级，90只，雌雄各半，精确称重，体质量12～18 g，由南京医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(苏)-2008-0004。苏木精、伊红试剂：武汉欣欣佳丽生物科技有限公司；醋酸铀试剂：西安鼎天化工有限公司。BT701-1B型针灸电针仪：购于上海华谊医用仪器有限公司；CX43奥林巴斯显微镜、JEM-1010 型透射电子显微镜：日本电子株式会社。

2 方法

2.1 实验动物分组、模型制备及处理 将90只实验大鼠随机分成假手术组、模型组和头针组，每组30只。假手术组：分离左颈总动脉不结扎，缝合切口，不做缺氧处理。不给予任何干预治疗。模型组：按照国际公认改良的HIE实验动物造模方法造模[5]。头针组：造模24 h后进行头部运动区电针刺激。参照《头针穴名国际标准化方案》[6]选择头部运动区，以颞前线、顶颞前斜线定位，针刺运动区头皮表面投影上2/5；造模后24 h开始，毫针浅刺，按一定方向沿皮下缓慢捻转进针，达到应有深度，进针后接通电针仪，正极、负极接左右针尾，频率 2 Hz，疏密波形，电流3.5 mA,每日1 次,每次3 min，7次为1 个疗程，停针2 d进入下一个疗程，共3 个疗程。

2.2 观察指标

2.2.1 神经功能状况评估 于造模后7、14、28 d每组各取10只实验大鼠，处死取样前按Bederson 法[7]进行神经功能评价。

2.2.2 光学显微镜观察受损脑组织病理学改变 于造模后7、14、28 d每组随机取10只实验大鼠,神经功能评价后，10%的水合氯醛按3 mL/kg剂量进行腹腔麻醉，断头处死,病理取材，切取大脑皮层1 mm×1 mm×1 mm组织块, 样本处理后，常规HE染色，制片，观察、拍照。

2.2.3 透射电镜观察受损脑组织神经细胞自噬变化 取材过程同2.2.2，待组织固定后，取出切成1 mm3大小3块，用4%的戊二醛固定4 h，1%的锇酸固定1 h，逐级乙醇丙酮脱水，环氧树脂618#包埋后，超薄切片，枸橼酸铅、醋酸铀双重染色，透射电镜观察受损脑组织超微结构及神经细胞自噬变化。

3 结果

3.1 各组大鼠各时段运动功能评估结果 见表1。

表1 各组大鼠各时段运动功能评分比较分)

3.2 各组大鼠脑组织病理学光镜观察结果 假手术组大鼠在各时段表现一致，脑组织结构完好，神经细胞大小均匀，依靠紧密，细胞核饱满。7 d时，模型组脑组织结构疏松，间质水肿，区域内神经细胞染色深，几乎所有细胞核出现固缩，脑损伤严重；头针组与模型组改变基本相同，但间质水肿程度稍轻。14 d时，模型组细胞染色依旧较深，可见很多鬼影细胞，但头针组脑组织水肿几乎消失，可见完好细胞结构进入损伤组织，鬼影细胞少量。28 d时，各组脑组织切片均可见恢复现象，但头针组脑组织结构更加紧密，且几乎没有固缩细胞核存在。见图1。

图1 各组大鼠第14 天脑组织光镜观察(HE，×400)

3.3 各组大鼠脑组织超微结构的透射电镜观察结果 假手术组可见双层模包绕内容物现象,自噬少见。模型组见神经细胞水肿，细胞器数量明显减少，线粒体绝大部分嵴和部分膜融合或消失，粗面内质网明显扩张，有明显的自噬现象，但以单层模为主。头针组：随着干预时间的延长，神经细胞水肿逐渐消失，细胞器数量明显增多，线粒体嵴断裂减少，空泡样改变明显改善，可见呈双层或多层膜包绕内容物的自噬现象，但少于模型组，第14天差异明显。见图2。

图2 各组大鼠第14天脑组织神经细胞自噬的电镜观察(×37 000)

4 讨论

以往有关脑瘫早期病理进程及促进神经功能康复方法机制研究多偏于神经元凋亡，而越来越多的研究证据表明，自噬参与了神经发育、神经元分化和神经损伤性疾病，而凋亡与自噬之间存在着复杂的交互作用，有效阻止神经元过度凋亡与自噬，可有效减轻脑组织损害[4]。以往本课题组临床观察及实验研究均证实电针刺激头部运动区治疗脑瘫方法简便、安全疗效，已得到同行认可[8]。本实验通过构建脑瘫大鼠动物模型，对电针刺激头部运动区调控神经细胞自噬，促进神经功能康复效果进行观察。研究发现模型组不同时间段的运动功能障碍严重，神经功能评分均较较假手术组低(P<0.05)，受损脑组织病理观察提示神经细胞死亡较多，神经细胞自噬明显；而头针组的神经运动功能评分在各时段均有增加，神经细胞自噬趋势减弱。上述研究结果说明在脑瘫缺血缺氧脑损伤过程中，神经细胞过度自噬导致神经细胞死亡增加，神经功能障碍严重；而电针刺激头部运动区对神经细胞自噬有调控作用，可有效减轻脑瘫脑损害，促进神经功能康复,但调控机制还有待进一步研究。