猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

董浩，原霖，毕一鸣，刘洋，刘颖昳，刘玉良，陈亚娜，顾小雪，王传彬

(中国动物疫病预防控制中心，北京 102618)

猪圆环病毒(PCV)为无囊膜的单股负链DNA病毒，是目前发现的最小的动物病毒，大小约为17 nm。PCV根据抗原性及基因组的不同分为猪圆环病毒1型(PCV1)、2型(PCV2)以及2016年新出现的3型(PCV3)。PCV1分离自猪肾细胞系PK15，它不致病，能够在PK15中稳定存在而不形成细胞病变；PCV2对猪有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病；PCV3感染可引起母猪厌食、PDNS及繁殖障碍等，对其研究尚处起步阶段。

PCV2引起的疾病近年来已成为严重危害我国养猪业的主要疾病之一[1]。1991年PCV2首次在加拿大被发现后，迅速在各个养猪国家蔓延，严重威胁着全球养猪业的发展。2000年，郎洪武等[2]首次报道了我国猪群感染PCV2的相关情况。2018年，何长生等[3]采用荧光定量PCR方法对来自安徽省3个地区12个猪场健康猪群进行PCV2检测，PCV2个体阳性率和群体阳性率分别是67.4%和91.7%。孙圣福等[4]对山东省生猪养殖、流通、屠宰加工等环节中PCV2污染状况的检测表明，养殖场、屠宰场、运输车辆、洗消中心的场点阳性率分别为5.88%、5.26%、5.88%和20.00%，样品阳性率分别为2.01%、1.68%、0.75%和2.90%。吴明臻等[5]对近几年浙江金华地区PCV2流行情况的研究表明，2012—2018年PCV2个体阳性率分别为10.16%、11.95%、8.50%、9.94%、6.19%、5.94%和8.28%。上述研究表明，我国当前PCV2的流行情况依然不容乐观，需要引起足够重视。

国内相关标准和规范中都规定了PCV的核酸检测方法[6-9]，但是目前国内外尚无机构或公司生产PCV相关的标准样品，无法评价检测试剂、验证检测能力和控制检测质量。基于此，本研究针对PCV1和PCV2开展了PCV分型鉴定核酸标准样品研制工作，获得了该病毒核酸检测定性标准样品，有望解决PCV在检测中存在的实际问题。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit试剂盒购自Omega公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kitv2 and Master Mix购自Thermo公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes购自伯乐公司；猪瘟病毒通用型实时荧光 RT-PCR检测试剂盒、猪伪狂犬病毒实时荧光 PCR 检测试剂盒、猪圆环病毒 2 型实时荧光 PCR 检测试剂盒、猪细小病毒实时荧光 PCR 检测试剂盒、支原体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株实时荧光PCR检测试剂盒均购自世纪元亨公司；引物探针由英潍捷基有限公司合成。

1.2 标准样品原料的制备

对PCV1序列(GenBank 登录号：JN133303)和PCV2序列(GenBank 登录号：HQ395021)全基因组序列进行分析，检查序列内部有无特别复杂二级结构和重复序列后，发送给英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。将合成好的序列装入pMD18-T载体并转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞。

将分别含有PCV1和PCV2全序列的阳性克隆在含有氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养至对数期，使用E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit试剂盒进行质粒提取。采用紫外分光光度法对质粒的纯度进行测定。对2个提取好的质粒分别进行无菌检验和无其他病毒(猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒)检验。

对上述2个提取的质粒分别用阴性稀释液进行适当倍数稀释后，采用数字PCR方法进行质粒浓度的初步测定。对稀释好的标准样品原料按照0.5 mL每管进行分装，2种质粒溶液各分装1 000管，置于-20 ℃储存。

1.3 均匀性评估

从分装好的标准样品原料中随机抽取30管标准样品，每管样本使用数字PCR方法进行检测3次。试验结果数据使用单因素方差分析方法对标准样品进行均匀性评估。

1.4 稳定性评估

为了评估制备的标准样品的稳定性，分别进行了长期稳定性评估和短期稳定性评估。

1.4.1 长期稳定性评估

分别在第1、6、12、18和24个月抽取5管PCV1、PCV2核酸定性标准样品使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测2次，计算平均值。使用回归方法对PCV1、PCV2核酸定性标准样品的检测结果进行长期稳定性评估。

1.4.2 短期稳定性评估

分别将制备的标准样品在4 ℃、25 ℃和37 ℃环境下存放60、21和6 d。抽取3瓶的PCV1、PCV2核酸定性标准样品使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测1次。使用t检验方法对PCV1、PCV2核酸定性标准样品进行短期稳定性评估。

1.5 标准样品的定值

1.5.1 特性值的测定

将分别含有PCV1和PCV2全序列的质粒使用M13F和M13R通用引物，分别送至生工生物工程(上海)有限公司、深圳华大基因科技有限公司、中美泰和生物技术有限公司进行测序分析。将3家测序的结果分别进行Blast分析。

1.5.2 参考值的测定

通过多个实验室合作定值方式对PCV1、PCV2核酸定性标准样品进行参考值的定值。在本研究中，委托了农业农村部兽医诊断中心、北京市动物疫病预防控制中心实验室、上海市动物疫病预防控制中心实验室、山东省动物疫病预防与控制中心实验室、河南省动物疫病预防控制中心实验室、辽宁省动物疫病预防控制中心实验室、吉林省动物疫病预防控制中心实验室和浙江省动物疫病预防控制中心实验室共8家实验室使用数字PCR技术对标准样品的参考值进行测定。汇总各家测定的定值数据后，先进行测定数据的处理[10]。对数据进行了组内可疑值检验、组间数据等精度检验剔除可疑值。在各组数据等精度的情况下，用t检验方法检验各组数据平均值是否存在显著性差异。如平均值无显著性差异，先合并数据，检验数据分布的正态性，在符合正态分布的情况下，可将多个平均值再次计算平均值，求出总平均值，即为参考值。

1.6 临床试用

上海市动物疫病预防控制中心、山东省动物疫病预防与控制中心和辽宁省动物疫病预防控制中心3家试用单位在检测日常临床样本时，将试用的PCV1、PCV2核酸定性标准样品进行荧光定量PCR检测，一次检测2管标准样品，每管重复检测3次。

2 结果

2.1 标准样品的制备

分别含有PCV1和PCV2基因组全长序列质粒的构建由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。对构建完成的质粒采用M13F和M13R通用引物进行双向测序。将获得的序列信息分别进行Blast序列分析，结果显示PCV1基因序列与已发表的PCV1 CCL33-UGent的复制相关蛋白和衣壳蛋白的基因序列(GenBank登录号：JN133303)相似度100%；PCV2基因序列与已发表的PCV2 08TJ株(GenBank登录号：HQ395021)相似度100%。

制备的核酸标准样品的物理性状呈无色均一液体，无絮状沉淀物或大块沉淀。无菌检验结果显示制备的标准样品原料涂布在无抗性的LB固体培养基上无细菌菌落生长；使用猪瘟病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒、猪伪狂犬病毒实时荧光 PCR 检测试剂盒、猪细小病毒实时荧光 PCR 检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测均为阴性；采用文献[6]方法和PCV2实时荧光 PCR 检测试剂盒分别检测含有PCV1和PCV2全序列的质粒溶液均为阳性。

2.2 均匀性检测

从分装好的标准样品原料中随机抽取30管样品，共进行了90次检测。根据自由度(v1,v2)及给定的显著性水平α，可由表查临界值的F值，算得F

表1 PCV1均匀性检测结果

表2 PCV2均匀性检测结果

2.3 稳定性检测

2.3.1 长期稳定性评估

长期稳定性评估则是测试标准样品在长期储存条件下(-20 ℃)的稳定性。分别在第1、6、12、18和24个月抽取5管标准样品进行稳定性评估，结果均小于对应的t0.05,n-2因子的分位数，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。上述结果说明本标准样品在-20 ℃环境下可稳定至少24个月。考虑到实际运输条件等因素对标准样品稳定性的影响，因此确定本标准样品可在-20 ℃下稳定保存24个月(表3和表4)。

表3 PCV1的长期稳定性结果

表4 PCV2的长期稳定性结果

2.3.2 短期稳定性评估

将标准样品分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃环境下存放60、21和6 d与存放在-80 ℃环境中的检测结果分别进行短期稳定性分析，结果均小于对应的t0.05,n-2因子的分位数，故认为未观测到不稳定性，说明本标准样品能满足实际测量的需要(表5和表6)。因此，标准样品可在4 ℃环境稳定60 d，25 ℃环境稳定21 d，37 ℃环境可稳定6 d。

表5 PCV1短期稳定性结果

表6 PCV2短期稳定性结果

2.4 标准样品的定值

委托8家实验室采用数字PCR方法对标准样品的参考值进行测量，最终测定PCV1、PCV2核酸定性标准样品的参考值分别为1.33×104copies/μL和1.11×104copies/μL 。

将PCV1、PCV2核酸定性标准样品分别送3家公司使用M13F和M13R通用引物进行测序。3家公司均获得了PCV1和PCV2全序列，通过Blast序列相似度比较，PCV1可溯源至GenBank登录号为JN133303的CCL33株，核苷酸序列相似度为100%；PCV2可溯源至GenBank登录号为HQ395021的08TJ株，核苷酸序列相似度为100%。

2.5 试用情况

委托的3家实验室采用现行的猪圆环病毒核酸检测标准对PCV1、PCV2核酸定性标准样品进行了试用，试验结果表明该标准样品质量稳定，检测结果均为阳性，能够与我国现行的PCV检测标准相匹配。

2.6 评审结论

制备的PCV1、PCV2核酸定性标准样品满足了国家标准样品的要求，通过了国家标准化管理委员会组织的专家评审。

3 讨论

检测结果的准确可靠对于实验室检测至关重要，这不仅要监测实验室检测过程中的人、机、料、法、环的正常运转，还需要采取有效的质量控制方式，从而实现长期有效的质量保证[11]。标准样品由于具有均匀性和稳定性，并且经过溯源，量值和不确定度是确定的，因此可以作为参照物或质控样品对检测数据的准确性和可靠性进行核查，从而帮助排查实验室人、机、料、法、环等影响因素的偏差，以便实验室采取有效的纠正和预防措施[12]。

实验室检测技术是PCV检测的重要手段，包括病毒分离、免疫荧光、免疫组化、酶联免疫吸附试验和分子生物学试验等方法。其中，分子生物学检测方法主要有常规PCR、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增等方法[13]。虽然目前我国已经有多项现行的PCV检测国家标准和行业标准，但是缺乏与之配套的猪圆环病毒检测相关的标准样品，无法评价检测试剂、验证检测能力和控制检测质量。在早期的相关研究中，高志强等[14]针对PCV2 QD/2014株ORF2片段构建了重组腺病毒核酸扩增检测标准样品，该种标准样品的优点是可以对DNA的提取过程进行质控，同时还能避免造成气溶胶污染。和上述研究相比，本研究研制的PCV1、PCV2核酸定性标准样品，一方面是提供了PCV1和PCV2两管标准样品适用于各种标准中的分型方法；另一方面本研究中的标准样品是基于PCV1和PCV2的全基因序列研制的，适用于所有类型的PCV核酸检测方法；除此之外，还通过数字PCR技术进行准确定量，将标准样品中的质粒拷贝数控制在104左右，最大限度地降低了气溶胶污染的发生。

综上所述，本研究研制的PCV1、PCV2核酸定性标准样品均匀性和稳定性均比较理想，经过多家实验室的临床试用为合格，通过了国家标准化管理委员会组织的专家评审，能够促进PCV实验室核酸检测的标准化和规范化。