巨菌草饲粮对七彩山鸡血液指标和脂肪相关基因的影响

裘博文，郝柳柳，邓新为，罗娜，赵鹤青，赖宝怡，孙志宏,2*

(1. 延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000；2. 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716000)

巨菌草(Pennisetumgiganteum)是狼尾属植物，为温带和热带多年生草本植物。1983年由国家菌草工程技术研究中心引进，是一种热利用率高的速生和优质饲料作物。巨菌草粗蛋白含量高达54.6%，粗纤维含量高达33%[1]，其富含多糖和粗蛋白的特征被认为可能具有提高动物免疫功能、减少疾病、改善生产性能的多种生理功能[2]，因此将高产优质的巨菌草纳入饲料添加剂研究前景广阔。

七彩山鸡(Phasianuscolchicus)的肉质鲜嫩、美味，含人体多种必需氨基酸[3]，是一种高蛋白、低脂肪和低胆固醇的优质肉类。七彩山鸡对饲料营养需求高，通常使用优质的肉鸡饲料来饲养，目前七彩山鸡各阶段的饲养主要靠生产者自己配制，配制时要特别注意七彩山鸡的营养需要量及原料要求。

近几年，在饲料中添加巨菌草用来降低饲料成本和改善饲养动物的生长健康状况的研究报道较少且相对单一[4-5]。本试验通过在基础饲料中添加不同含量的巨菌草饲喂七彩山鸡，根据血液生理生化指标以及脂蛋白脂酶(LPL)基因和钙激活蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在肌肉组织中表达量，探明日粮中添加巨菌草的适宜含量，为后续指导巨菌草饲料饲养七彩山鸡提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 基础饲料及营养水平

七彩山鸡饲料参照鸡饲养标准[6]，并进行适当调整，饲料分别由精料、麸皮和巨菌草搭配而成。选用生长周期为90 d的巨菌草，通过柔丝粉碎晾干后，再与其余饲料加工成颗粒进行饲喂。巨菌草营养成分为：粗灰分19.4%、粗蛋白质27.2%、粗脂肪2.2%、粗纤维16%、钙6.74%、钙6.74%。各试验组日粮配方及营养水平见表1。

表1 试验日粮配方和营养水平(干物质)

1.2 试验动物与样品采集

选用西安市集美生态农业有限公司提供的七彩山鸡210只(1周龄)，分为1个对照组和4个不同水平巨菌草饲料处理组，每组3个重复，每个重复14只。试验在陕西省延安大学萃园实训基地进行。试验开始前对鸡舍进行彻底打扫和消毒。每天7:00和16:00投料。饲养周期为16周，饲养管理一致，自由饮水。

饲养试验结束时，从每组中各选取12只七彩山鸡，共60只，前1 d下午开始禁食，早晨空腹在翅膀处静脉采集全血，注入血成规管和生化管中，上下摇动，在延安大学附属医院进行血液生理生化指标的测定。

1.3 七彩山鸡LPL基因和CAST基因PCR检测

运用Primer Premier 5.0软件设计引物，根据七彩山鸡LPL基因和CAST基因的序列设计PCR扩增引物，引物信息见表2，引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。取心、胃、胸和腿肌组织共100 mg，利用试剂盒提取总RNA，用超微量分光光度计检测总RNA的OD值，OD值在1.8～2.0(实测1.95～2.0)之间，可进行下一步试验，参照反转录试剂盒(Roche)说明书将抽提的RNA反转录成cDNA。以各七彩山鸡最长肌总cDNA为模板，采用表2中引物序列，进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL：RNase-free 水 8 μL，2×T5 Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，1 260 μg/mL的cDNA模板1 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40个循环。

表2 引物核苷酸信息

1.4 LPL基因和CAST基因PCR荧光定量检测

按1.3中的方法提取20种组织的cDNA，心肌、胃、胸肌和腿肌的cDNA各5种。以cDNA为模板进行荧光定量PCR。荧光定量PCR反应体系为20 μL：RNase-free 水 7.8 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，通用型SYBR Green 预混液 10 μL，140 μg/mL 的cDNA模板 2 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40个循环。以β-action基因(GenBank登录号分别为： NM_205282和NM_001034034.2)作为内参基因，对LPL和CAST基因进行标准化，检测数据采用2-ΔΔCt值法计算mRNA相对表达水平。

1.5 数据处理

采用SPSS软件(版本24.0)对数据进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示。使用One-way ANOVA方差分析比较不同试验组的显著性差异，显著性水平为P<0.05。基因表达量采用GraphPad Prism(版本6.0)制图。

2 结果与分析

2.1 生长性能指标

由表3可知，4个添加巨菌草组的七彩山鸡平均体重都高于对照组，其中以8%添加量最高，差异显著(P<0.05)；平均日采食量相对于对照组均有所增加，但差异不显著(P>0.05)；平均日增重显著大于对照组(P<0.05)，以12%巨菌草组最高；料重比与对照组相比均有所下降，以添加量8%时差异最为明显(P<0.05)。

表3 七彩山鸡生长性能指标的测定结果

2.2 血液生理指标

由表4可知，七彩山鸡饲粮中加入不同比例的巨菌草对于血液中的红细胞数(RBC)、平均红细胞体积(MCV)、胞血红蛋白浓度(MCHC)和平均红细胞体积宽度(RDW-SD)无明显差异。对照组白细胞数(WBC)最低，巨菌草水平为8%的试验组与其他组相比差异显著(P<0.05)；8%和12%巨菌草组的红细胞比积(HCT)与对照组相比显著升高(P<0.05)；平均血小板体积(MPV)巨菌草组均高于对照组，其中巨菌草水平为8%和12%的差异显著(P<0.05)；血小板体积分布宽度(PDW)巨菌草组均低于对照组，8%巨菌草组显著降低(P<0.05)。

表4 七彩山鸡血液生理指标的测定结果

2.3 血液生化指标

由表5可知，8%巨菌草组的总蛋白(TP)显著高于其他组(P<0.05)；白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)和高密度脂蛋白(HDL-C)在添加巨菌草后都有所升高，但差异不显著(P>0.05)；8%巨菌草组的血清球蛋白(GLO)比对照组明显升高，且差异显著(P<0.05)；甘油三酯(TG)含量在添加巨菌草后呈现降低趋势，以8%添加量的降低幅度最为明显(P<0.05)；巨菌草组总胆固醇(TC)含量均低于对照组，其中12%添加量差异显著(P<0.05)；低密度脂蛋白(LDL-C)的含量随巨菌草添加水平提高表现为下降趋势，且12%和16%巨菌草组差异显著(P<0.05)；各组尿素(Urea)含量无明显差异(P>0.05)。

表5 巨菌草对七彩山鸡血液生化指标的影响

2.4 LPL基因在不同组织中的表达

由图1可知，在胸肌组织中，LPL基因的表达量随着日粮中巨菌草含量的增加表现为先升高后降低的趋势，添加8%和12%巨菌草组与对照组相比差异显著(P<0.05)；在胃组织中，日粮中添加12%巨菌草时LPL基因的表达量达到最高值，且与对照组表达量相比增高，差异显著(P<0.05)。 在心肌和腿肌中，添加巨菌草组LPL基因表达量与对照组无明显差异(P>0.05)。

注：相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同图1 LPL基因在胸肌(A)、心肌(B)、腿肌(C)和胃(D)中的表达量

2.5 CAST基因在不同组织中的表达

由图2可知，在胸肌组织中，添加巨菌草组CAST基因表达量与对照组相比无明显差异(P>0.05)；而在腿肌组织中，CAST基因在12%巨菌草组的表达量显著高于对照组(P<0.05)；在胃组织中，CAST基因在8%巨菌草组的表达量显著高于对照组(P<0.05)；在心肌组织中，CAST基因在12%巨菌草组的表达量显著高于其他组(P<0.05)，4%和8%巨菌草组显著高于对照组(P<0.05)。

图2 CAST基因在胸肌(A)、腿肌(B)、胃(C)和心肌(D)中的表达量

3 讨论

3.1 巨菌草饲料对七彩山鸡生长性能的影响

在畜禽类动物的饲粮中加入巨菌草添加剂，动物的生长和免疫性能都有所改善[7]。禽类对饲料的利用率可以通过增加采食量、进食次数、多次食糜来改善对营养物质的消化和吸收[8]。有研究发现，在羊的饲粮中添加一定量的草粉，可使羊对饲料中的多糖和粗蛋白等的代谢能力增强，提高羊对饲粮的吸收率[9]。在本试验中，8%巨菌草组七彩山鸡的平均体重显著增加；4组巨菌草组平均日采食量提高但不显著，日增重均显著增加，料重比均有所降低，其中8%巨菌草组降低显著，这些与上述观点相符合。

3.2 巨菌草饲料对七彩山鸡血液生理生化指标的影响

白细胞参与体内免疫反应，对抵抗体外抗原物质有着不可或缺的作用，红细胞比积增大可以增加血液的承载能力[10-11]；红细胞体积分布宽度、平均红细胞体积是反映血液中血小板体积变化的参数，而平均血小板体积和血小板体积分布宽度一定程度上反映血小板功能和血小板活性，是检测贫血的重要指标[12-13]。血液生化指标可以比较准确地反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况，研究表明血清中的总蛋白、白蛋白和球蛋白含量的提高，有助于增强动物体蛋白质代谢和营养的吸收[14-15]。本研究发现，日粮中添加8%巨菌草对七彩山鸡血液生理指标均有所改善，其中白细胞数、红细胞比积、平均血小板体积、血小板体积分布宽度差异显著，表明七彩山鸡日粮中添加巨菌草可以促进动物生长发育，提高动物的免疫力。对生化指标来说，添加8%巨菌草可显著提高七彩山鸡血液中的总蛋白、血清球蛋白和甘油三酯含量，因为巨菌草富含粗纤维和粗蛋白，可以改善动物肠绒毛形态，从而促进对高蛋白和多糖的吸收，进一步改善山鸡的血液指标，提高山鸡的免疫性能。

3.3 巨菌草饲料对脂肪相关基因表达的影响

LPL和CAST基因的活跃与否直接影响着动物的生长。LPL基因主要在动物脂肪组织、心肌组织、骨骼肌组织和乳腺组织中表达，是肉质性状候选基因之一[16-17]；而CAST基因是参与动物体生长、代谢以及机体内相应的生理生化反应过程的调节基因之一，它能有效地保护蛋白质，以防止被降解，从而加快肌肉的增长[18]。LPL和CAST基因的表达量可以作为观察动物生长状况的重要指标。有研究表明，LPL和CAST基因具有促进甘油三酯蛋白降解和调控肌肉生长过程中蛋白质更新的作用，不同的肌组织LPL和CAST基因所需表达量不同，因此导致各组织之间存在不同的LPL和CAST基因表达量[19-20]。巨菌草富含多糖，这一特性对于改善动物的肠绒毛形态具有一定的可能性[21]，同时其富含氨基酸和蛋白质的特性为改善动物肉品质提供了可能[22]。以上研究均与本研究所得出结果相吻合。本研究表明，在饲粮中添加不同水平的巨菌草可以使LPL基因出现差异表达，在饲粮中添加量为8%时，该基因在胸肌和胃的表达量与其他组织相比差异最为显著；而对于CAST基因来说，表达量的多少因添加量的不同而改变，添加8%～12%的巨菌草可以显著影响CAST基因在心肌、胃、胸肌、腿肌组织中表达量，但其影响的规律性有待进一步研究。

4 结论

通过在七彩山鸡日粮中添加不同水平巨菌草饲料发现，添加8%巨菌草对其生长性能和血液生理生化指标均有所改善，可提高免疫力；日粮中添加8%～12%含量的巨菌草，对LPL和CAST两种重要的脂肪代谢基因的表达量影响最为显著，对脂肪的代谢和蛋白质的更新有一定的促进作用，但相关的作用机制还需进一步探索。