高浓度纳米银的制备及其抗菌效果评价*

张金伟，王 瑶，温永汉，孙宏斌，余国枢，陈武勇

(1. 四川大学 皮革化学与工程教育部重点实验室， 成都 610065； 2. 四川达威科技股份有限公司， 成都 610041； 3. 广东省江门市质量计量监督检测所，广东 江门 529000； 4. 广东盛方化工有限公司，广东 江门 529162)

0 引 言

纳米银通常指粒径小于100 nm的金属银单质，由于纳米银的表面效应，同等浓度下其抑菌能力明显强于银单质，而且不会产生耐药性，具有低毒性和强抗菌活性等优点[1-2]。目前，在皮革、裘皮、造纸、包装、纺织和涂料等行业中，纳米银已被广泛使用[3-8]。纳米银的制备主要有物理方法、化学还原和生物还原等方法[9]，其中化学合成法操作简单，目前较为常用。由于纳米银表面能较高，易团聚沉降，制备时往往需使用保护剂或稳定剂防止其团聚，常用的保护剂有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和明胶等[10]。表面活性剂为具有双亲性基团的长链分子，其长链的位阻效应可有效防止纳米粒子发生团聚，同时在溶液中形成的胶束可为纳米银的生成提供模板[11]。其中，阳离子表面活性剂常被作为模板和助稳定剂制备纳米材料[12]。

以苯扎溴铵为保护剂、硼氢化钠为还原剂，采用模板法制备的纳米银抗菌剂中银浓度为2.4×10-5g/mL[13]，由于苯扎溴铵本身就是一种具有杀菌能力的阳离子表面活性剂，该方法制备的纳米银具有良好的抗菌效果，并且可与胶原蛋白和角蛋白产生相互作用，可用于生产和加工具有持久抗菌性能的皮革和裘皮产品[14-17]。在纳米银抗菌剂的使用过程中，由于其有效物含量较低，为达到理想的抗菌效果，不仅使用时用量大，产品在包装和运输上的费用也会增加，最终导致综合使用成本较高，极大地制约了纳米银抗菌剂的工业化生产和大规模应用。因此，在现有技术方案的基础上制备有效物浓度更高的纳米银就十分必要。

目前，关于提高纳米银浓度的方法主要是使用保护剂和增稠剂。保护剂分子在纳米银粒子表面形成吸附层，产生空间位阻效应，有效阻止颗粒间相互聚集，提高溶液的稳定性[18]。在纳米银溶液中加入聚氨酯增稠剂，可以显著提高其中银的浓度[19]，但会使纳米银粘度大幅增加，成本也较高。苯扎溴铵是一种表面活性剂，其在溶液中浓度超过临界胶束浓度时会产生胶束包裹纳米银，防止纳米银团聚，通过改变苯扎溴铵的用量，有望在不明显改变溶液性质的前提下大幅提高纳米银浓度，从而降低纳米银的用量和物流成本，为纳米银抗菌剂的产业化应用奠定基础。

1 实 验

1.1 实验试剂与仪器

1.1.1 试剂

硝酸银、硼氢化钠，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；苯扎溴铵，5%水溶液，南昌白云药业有限公司；异噻唑啉酮(2-甲基异噻唑啉酮与5-氯-2甲基异噻唑啉酮质量比为1∶3)，总含量为14%，大连汇邦化学有限公司。

1.1.2 仪器

DHL-B电脑定时恒流泵，上海青浦沪西仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸易有限公司；Lambda 25紫外可见分光光度计，美国Perkin Elmer公司；NanoZS激光粒度仪，英国Malvern仪器公司。

1.2 样品制备方法

1.2.1 高浓度纳米银的制备

以现有纳米银制备方法为基础(银浓度为2.4×10-5g/mL)[13]，等比例地提高各试剂的用量为基础用量的10倍，其中保护剂苯扎溴铵的用量扩大10倍后再增加1倍(1B)、3倍(3B)、4倍(4B)、5倍(5B)、6倍(6B)、7倍(7B)，具体配方见表1，以研究保护剂用量对高浓度纳米银溶液粒径和稳定性的影响，制定最佳工艺。

表1 不同苯扎溴铵用量下高浓度纳米银溶液制备配方

1.2.2 纳米银抗菌剂的制备

纳米银与有机抗菌剂复配，可以明显提高其抗菌性能[20]。为进一步提高纳米银的抗菌效果，利用高效、低毒的有机抗菌剂异噻唑啉酮与所得纳米银进行复配，制备纳米银抗菌剂。将高浓度纳米银溶液(银浓度为2.4×10-4g/mL)，与异噻唑啉酮溶液按照100∶0.8(w/w)的比例进行复配。复配时将异噻唑啉酮在搅拌条件下缓缓加入纳米银溶液，滴加完成后继续搅拌10 min即完成复配。

1.3 分析测试方法

1.3.1 紫外-可见光谱测试

用Lambda 25紫外可见分光光度计，设定测试温度为25 ℃，扫描速度为240 nm/min，在300～800 nm的波长范围内扫描并记录纳米银溶液的吸收光谱曲线。

1.3.2 动态光散射测试

平均粒径及Zeta-电位分析用Nano ZS激光粒度仪对纳米银溶液的平均粒径和Zeta电位值进行测定，取3次测试结果的平均值作为最终结果，测试温度为25 ℃，测试前设定温度下平衡3 min。

1.3.3 透射电镜分析

用JEM-100CXII透射电镜，在加速电压为200 kV的条件下观测纳米银的粒径大小和形貌。测试前，将1-2滴的纳米银溶液滴到孔径为200目的铜网上，自然干燥后即可进行测试。

1.3.4 纳米银复合抗菌剂抗菌性能的测定

配制牛肉膏蛋白胨和孟加拉红培养基[21]，并在121 ℃条件下，灭菌21 min备用。配制菌液浓度为5×105～106cfu/mL的细菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液、菌体浓度为1.0×105～106cfu/mL的黑曲霉和粘性红圆酵母菌悬液。

10 mL培养基与纳米银抗菌剂混合均匀后倒入培养皿，控制培养基中纳米银抗菌剂浓度依次为1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL；待培养基凝固后加入1 mL的菌悬液，均匀涂布在培养基表面；最后，将培养皿置于37 ℃和90%相对湿度的培养箱中，培养24 h后观察微生物生长情况，运用平板计数法计算菌落数。

2 结果与讨论

2.1 不同保护剂用量对纳米银稳定性的影响

2.1.1 紫外-可见光吸收光谱分析

图1为不同苯扎溴铵用量下高浓度纳米银溶液的紫外-可见吸收光谱图。

图1 不同苯扎溴铵用量下纳米银溶液的紫外-可见光谱图Fig 1 UV-vis spectra of nano-sliver solution prepared with different benzalkonium bromide dosage

从图1中可见，当纳米银溶液的浓度提高10倍后，苯扎溴铵保护剂用量在基础用量扩大10倍后再增加1、3、4、5、6和7倍时，其最大吸收波长分别对应为417 、412 、412、413 、414 和414 nm。当保护剂用量最少(1倍)时，其最大吸收波长为417 nm，出现了较明显的红移，且与之对应的吸光度值相对较低，半峰宽较大，说明在该溶液中，纳米银粒子粒径较大，溶液中胶体粒子的均一性较差、稳定性较低[22]。在其他苯扎溴铵用量下生成的纳米银最大吸收波长在412～414 nm，且不同样品的半峰宽相近，说明此时溶液中纳米银粒子分散性和均一性都较好。

当溶液中苯扎溴铵含量较少时，所形成的胶束无法完全负载纳米银，也不足以有效防止纳米粒子的团聚，因此纳米银胶团粒径增大，溶液的稳定性变差，紫外特征吸收峰红移。随着溶液中加入的苯扎溴铵含量的增加，阳离子型的苯扎溴铵分子的亲水基端向外与水分子作用，疏水基端向内与纳米银粒子相互吸附作用，在纳米银粒子周围形成了有效的空间位阻，阻止了纳米银粒子之间的团聚作用，最终生成了较为均一的纳米银粒子，胶体稳定性也有所改善。

2.1.2 激光粒度仪分析

图2为不同苯扎溴铵用量对纳米银粒子粒径和Zeta电位的影响。

图2 苯扎溴铵用量对纳米银粒子粒径和Zeta电位的影响(左侧为粒径，右侧为Zeta电位)Fig 2 Influence of benzalkonium bromide dosage on average particle size and Zeta potential of nano-sliver particles (particle size on left and Zeta potential on right)

从图2中左侧的粒径结果可知，在10倍基础浓度纳米银溶液中，当苯扎溴铵的用量在基础用量扩大10倍的基础上再增加1倍(1B)时，所生成的纳米银粒子的平均粒径高达64.73 nm，原方法中所制备纳米银的浓度为26 nm[13]，这是因为较少用量的苯扎溴铵难以形成有效的空间位阻，不能有效抑制纳米银胶团的聚集，因此纳米银粒子粒径增大。随着苯扎溴铵用量的增加(4B、5B)，对应的纳米银溶液中所生成的纳米银粒子粒径较小，与原浓度条件下差别不大，这是因为苯扎溴铵分子与纳米银粒子相互作用后，在溶液中形成了有效的空间稳定层，降低了纳米银粒子之间的团聚。当保护剂用量继续增加后(7B)，纳米银粒径又出现明显的增加，这可能是因为当溶液中苯扎溴铵过量时，苯扎溴铵分子之间相互缠结，在一定程度上削弱了胶团的空间位阻，苯扎溴铵形成的胶束无法有效地负载纳米银粒子，使得粒子之间出现了软团聚，导致纳米银粒子粒径增大。

Zeta电位又称ζ-电位或动电电位，是指在外电场的作用下，分散粒子的稳定层与扩散层发生相对移动时，滑动面(或剪切面)的电位，是胶体体系的电化学性质的主要指标之一，一般来说Zeta电位绝对值越大，则该胶体溶液的稳定性越好。图2中右侧Zeta电位可知，纳米银溶液的Zeta电位值随着苯扎溴铵用量的增加，呈现先增大后减小的变化趋势。当苯扎溴铵用量为1B和3B时，Zeta电位绝对值相对较低(低于30 mV)，说明此时纳米银溶液中胶团稳定性较差；当苯扎溴铵用量增加到4B-5B时，Zeta电位绝对值分别为44.37和40.12 mV，说明该保护剂用量下，苯扎溴铵分子与纳米银粒子作用后，纳米银胶团表面所带电荷增加，双电层变厚，所制备的纳米银溶液具有较高的稳定性；当保护剂用量继续增加到6B-7B时，所制备的纳米银溶液Zeta电位绝对值开始下降，说明包裹在纳米银粒子表面的苯扎溴铵分子达到饱和，继续增加保护剂，苯扎溴铵分子之间会发生一定缠结作用，不利于提高纳米银的稳定性。

2.1.3 透射电镜分析结果

从6个不同的苯扎溴铵用量所得样品中选取了具有代表性的1B、4B和7B纳米银溶液进行透射电镜图谱的扫描，所得结果如图3所示。

当苯扎溴铵用量为1B时，纳米银的粒径在10 nm左右，但是大量的纳米银粒子团聚在一起，形成了较大的纳米银簇(图3(a))；当苯扎溴铵用量为4B时，纳米银平均粒径为20 nm左右，且具有较好的分散性和均一性(图3(b))，当保护剂用量为7倍时，纳米银粒径为40 nm左右且吸附团聚在一起，形成了较大的纳米银簇，纳米银的粒径也不均一(图3(c))。

图3 不同苯扎溴铵用量下纳米银的透射电镜图Fig 3 TEM images of nano-sliver prepared with different benzalkonium bromide dosage

根据上述结果，可以得出了苯扎溴铵与纳米银粒子的作用的机理，如图4所示。

图4 苯扎溴铵与纳米银粒子作用示意图Fig 4 Schematic of nano-silver particles capped with benzalkonium bromide

由图4所示，当Ag+得到电子生成Ag原子后，如果没有保护剂将形成单质银沉淀，苯扎溴铵加入后，其分子的亲水端向外与水介质接触，疏水基与银粒子发生吸附作用将其包裹在内，形成有效的空间稳定层而产生纳米银粒子。当苯扎溴铵分子过少时(图4(a))，苯扎溴铵分子不足以将溶液中的纳米银粒子包裹完全，较多裸露的纳米银粒子通过自身的布朗运动，相互吸附团聚，使得溶液的稳定性降低。随着苯扎溴铵浓度的增加，纳米银粒子外形成了有效的空间稳定层，阻止了纳米银粒子之间的吸附作用，从而提高了胶团的稳定性(图4(b))。当苯扎溴铵过量时，苯扎溴铵分子之间相互缠结，极大的挤压和破坏纳米银粒子外部的空间稳定层，使得纳米银粒子吸附团聚，纳米银粒子平均粒径增大，溶液稳定性降低(图4(c))。

2.2 纳米银抗菌剂的抗菌效果评价

为考察纳米银抗菌剂的抗菌性，选择金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、粘性红圆酵母(Rhodotorulamucilaginosa)和黑曲霉(Aspergillusniger)等4种革制品中常见菌株[23- 24]，对每种菌株的最小抑菌浓度(MIC)进行测定，结果如表2所示。

表2 纳米银抗菌剂对不同菌株的最小抑菌浓度

由表2可知，纳米银抗菌剂对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的抑菌效果最好，其最小抑菌浓度仅为1.0 μg/mL，对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)也具有很好的抑菌效果，其最小抑菌浓度为2.0 μg/mL，纳米银抗菌剂对真菌类的黑曲霉和粘性红圆酵母的抑制效果较细菌稍差，其最小抑菌浓度均为4.0 μg/mL。上述结果表明纳米银与异噻唑啉酮复配后制备的抗菌剂杀菌能力强、抗菌谱广。虽然实验结果中抗菌剂对4类菌株的最小抑菌浓度稍有差异，在实际使用纳米银抗菌剂生产抗菌皮革制品时，其用量大于4.0 μg/mL时即可对所有菌株都起到良好抑菌作用。

3 结 论

通过考察不同用量的保护剂苯扎溴铵对纳米银溶液稳定性的影响，发现保护剂用量为8×10-3g/mL时，所制备的纳米银溶液具有较好的稳定性，纳米银胶团分散性和均一性较好，平均直径约30 nm。该纳米银与异噻唑啉酮按质量比100∶0.8复配后制得的纳米银抗菌剂具有广谱高效的抗菌效果，对大肠杆菌的最小抑菌浓度仅为1.0 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.0 μg/mL，对黑曲霉和粘性红圆酵母的最小抑菌浓度为4.0 μg/mL。本研究所制备的纳米银浓度为2.4×10-4g/mL，比文献报道的浓度提高了10倍，有利于促进该产品的产业化和推广应用。