甲状腺功能亢进症模型大鼠心肌细胞PI3K/Akt通路与胰岛素抵抗的关系*

王万民, 田涛

三门峡市中心医院内分泌科(河南三门峡 472000)

甲状腺功能亢进症(甲亢)是一种常见疾病，由甲状腺激素分泌过多引起，会引起高代谢、免疫炎症反应、神经系统兴奋性增加，导致体重减轻、肝损伤、心血管疾病等并发症[1-2]，甲亢性心脏病是其中常见并发症，过多甲状腺激素可引起心肌细胞代谢加速、交感-迷走神经张力失衡、心肌炎性及氧化应激等，最终导致心肌重构、心肌纤维化及心功能不全等心脏病理改变[3-4]；另外炎症因子会降低胰岛素敏感性，引发甲亢性心脏病患者胰岛素抵抗，且研究发现心肌胰岛素抵抗引发心脏病理改变，促发心血管疾病，因此恢复心肌胰岛素信号正常激活具有重要心血管保护作用[5-6]。PI3K/Akt通路可调控心肌炎症反应，盐酸右美托咪定通过激活该通路可降低炎症因子合成，抑制炎症反应，减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤[7]，另外PI3K/Akt通路还介导胰岛素抵抗过程，脱氧野百合素可通过激活糖尿病小鼠骨骼肌PI3K/Akt通路显著提高其胰岛素敏感性[8]，因而推测PI3K/Akt通路可能通过介导炎症反应调控胰岛素抵抗，进而影响甲亢大鼠心肌损伤过程。2017年9月至2019年3月本研究通过建立甲亢大鼠模型，对其心肌细胞PI3K/Akt通路与胰岛素抵抗的关系进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重(180±20)g，购自维通利华动物试验中心提供，合格证编号：SCXK2017-0003，饲养在本院动物房，维持温度18～25℃，相对湿度50%～70%，12/12 h交替光照，自由摄食、饮水。

1.1.2 主要试剂与仪器 左旋甲状腺素钠(日本东京化成工业株式会社)，批号：XIBRG-OD；LY294002(美国MCE公司)，货号：HY-10108 ；740Y-P(美国Selleck生物科技有限公司)，货号：S7865；游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)及促甲状腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)ELISA测定试剂盒(北京北方生物技术有限公司)，批号均为：201611001；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、大鼠白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司)，批号分别为：201702、201702；兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT一抗、羊抗兔二抗(美国Abcam公司)，货号分别为：ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab150077；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA试剂盒(上海碧云天公司)，货号分别为：C1088、P0013K、P0011等。CKX41-F32F显微镜(日本 Olympus 公司)；血糖测试仪(强生上海医疗器械有限公司)；Cobas E602全自动电化学发光分析仪(Roche公司)；Elx800酶标仪、1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot SD半干转膜仪、Chemi-Doc XRS化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)；Centrifuge 5424R低温高速离心机(德国 Eppendorf 股份公司)等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组给药 参照文献[9]，SD大鼠每天以280 μg/kg剂量皮下注射左旋甲状腺素钠，持续7 d，禁食12 h，行尾静脉取血，检测血清中FT3、FT4、TSH含量，FT3、FT4水平显著升高，TSH显著水平降低，表示模型制备成功。共制备模型40只，成功36只，随机分为模型组、LY294002组、740Y-P组，每组12只；另取12只大鼠等剂量皮下注射生理盐水，设为对照组。

参照文献，以生理盐水分别溶解LY294002、740Y-P配制为溶液，LY294002组大鼠0.3 mg/kg[10]剂量尾静脉注射，740Y-P组大鼠以3.5 mg/kg[11]剂量腹腔注射。对照组大鼠与模型组大鼠，以与LY294002组同剂量生理盐水尾静脉注射，与740Y-P组等剂量的生理盐水腹腔注射，持续7 d。

1.2.2 标本收集及大鼠甲状腺功能指标检测 用药结束后，大鼠禁食12 h，麻醉后处死，经腹主动脉取血5 mL，分出2 mL离心取血清，以ELISA测定试剂盒分别检测其中FT3、FT4及TSH含量，具体操作参照说明书。解剖分离心肌组织，剪取约0.5 g储存在-80℃冰箱备用，剩余组织以生理盐水漂洗干净，4%多聚甲醛固定、梯度酒精(从低到高)脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，采用切片机做病理切片备用。

1.2.3 大鼠空腹血糖水平(fasting blood glucose，FBG)、胰岛素抵抗指数(insulin resistance index，IRI)测定 采用血糖测试仪检测1.2.2中腹主动脉血(2 mL)中FBG水平，并以全自动电化学发光分析仪检测其中胰岛素(fasting insulin，FINS)水平，然后计算IRI，公式为：IRI=FBG×FINS/22.5。

1.2.4 大鼠心肌细胞凋亡检测 1.2.2中切片经脱蜡、高浓度到低浓度酒精漂洗后，以3%H2O2溶液室温孵育15 min，然后以TUNEL试剂盒进行染色，具体操作参照说明书，再次以低浓度到高浓度酒精脱水、二甲苯透明，最后封片，在光学显微镜下观察，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕黄色，任意选取5视野拍照，计算凋亡细胞率=凋亡细胞/(凋亡细胞+正常细胞)×100%。

1.2.5 大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6水平测定 1.2.2中的腹主动脉血1 mL离心取血清，以ELISA试剂盒检测其中TNF-α、IL-6水平，具体操作参照说明书。

1.2.6 蛋白印迹法检测PI3K/Akt通路蛋白表达检测 1.2.2中心肌组织剪碎后，加入蛋白裂解液制备为匀浆液后离心取上清液，参照说明书步骤以BCA试剂盒测定总蛋白浓度，煮沸变性后取等量蛋白样品上样，进行电泳分离蛋白，然后将其湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，根据目的蛋白分子量大小截取蛋白条带置于孵育盒中，分别加入兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT一抗，4℃孵育，置于摇床上过夜，TBST洗膜3次，HRP标记的羊抗兔二抗中孵育2 h，再次洗膜后，以ECL化学发光液显色，采用化学发光成像系统成像，以Gel-ProAnalyzer 4软件分析各条带灰度值，得出各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件，计量资料组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠甲状腺功能情况 与对照组比较，模型组大鼠血清FT3、FT4显著升高，TSH显著降低；与模型组比较，LY294002组大鼠血清FT3、FT4升高，TSH降低；740Y-P组大鼠血清FT3、FT4降低，TSH升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠甲状腺功能比较(n=12)

2.2 各组大鼠FBG水平与IRI值 与对照组比较，模型组大鼠FBG水平、IRI值显著升高；与模型组比较，LY294002组大鼠FBG水平、IRI值升高；740Y-P组大鼠FBG水平、IRI值降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况 与对照组比较，模型组大鼠凋亡心肌细胞比例显著升高；与模型组比较，LY294002组大鼠凋亡心肌细胞比例升高；740Y-P组大鼠凋亡心肌细胞比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、表3。

表2 各组大鼠FBG、IRI水平比较(n=12)

注：A：对照组；B：模型组；C：LY294002组；D：740Y-P组。正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕黄色

表3 各组大鼠凋亡心肌细胞比例比较(n=12)

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平 与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平显著升高；与模型组比较，LY294002组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高；740Y-P组大鼠血清TNF-α、IL-6水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较(n=12)

2.5 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt通路蛋白表达情况 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著降低；与模型组比较，LY294002组大鼠血清心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt降低；740Y-P组大鼠血清p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、表5。

表5 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt通路蛋白相对表达比较(n=12)

3 讨论

甲亢病因主要由甲状腺功能本身的增加而分泌更多甲状腺激素，中国发病率约为1.2%[12]，甲亢性心脏病是其严重并发症之一，心脏在高水平甲状腺素长期作用下，会产生心肌肥厚、心肌重构及心肌纤维化等严重病理损伤，导致心力衰竭、心肌梗死或心律失常等心血管疾病，严重影响甲亢患者预后[13]。甲亢患者普遍存在胰岛素抵抗，原因与患者机体炎症反应及胰岛素受体数量下降密切相关[14-15]，而胰岛素抵抗作为机体异常病理状态，在动脉粥样硬化性、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的发生发展中起显著作用[16]，因此关于胰岛素抵抗的研究对甲亢性心脏病的临床治疗具有重要意义。研究发现，FT3、FT4、TSH作为甲状腺功能指标，在甲亢患者中FT3、FT4明显升高，TSH明显下降，使得患者机体处于高代谢状态，对葡萄糖的吸收增强，血糖升高，造成糖代谢功能紊乱[17]；炎性因子IL-6、TNF-α，可促进机体免疫炎症反应，导致心肌细胞凋亡，炎性细胞浸润等心肌损伤，在甲亢性心脏病病理过程中发挥重要作用[13-14,18]。本研究以皮下注射左旋甲状腺素钠方法建立甲亢模型大鼠，结果显示持续注射7 d后，大鼠血清FT3、FT4、TNF-α及IL-6水平、心肌细胞凋亡比例、FBG、IRI显著升高，TSH显著降低，表明建模大鼠甲状腺功能增强，血糖升高，出现甲亢症状及胰岛素抵抗，发生炎症反应，造成心肌凋亡受损，提示造模成功。

PI3K/Akt通路在机体免疫炎症反应及胰岛素抵抗中起重要调控作用，黄芪多糖可通过激活该通路减轻缺氧/复氧导致的大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡[19]；且二甲双胍可通过促使该通路磷酸化激活，降低2型糖尿病大鼠的肝胰岛素抵抗[20]，因而推测心肌细胞PI3K/Akt通路可能通过调控炎症反应影响胰岛素抵抗。本研究结果显示，模型大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt降低，经PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理后，大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt降低，血清FT3、FT4、TNF-α及IL-6水平、心肌细胞凋亡比例、FBG、IRI升高，TSH降低；经PI3K/Akt通路激动剂740Y-P处理后，大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt升高，血清FT3、FT4、TNF-α及IL-6水平、心肌细胞凋亡比例、FBG、IRI降低，TSH升高，表明甲亢大鼠心肌细胞PI3K/Akt通路介导胰岛素抵抗，该通路在甲亢大鼠中磷酸化水平相比正常大鼠明显降低，处于抑制状态，促使其磷酸化激活可使甲状腺功能恢复正常，抑制炎症反应，减少心肌细胞凋亡，改善胰岛素抵抗。

综上所述，甲亢大鼠心肌细胞PI3K/Akt通路与其胰岛素抵抗密切相关，调控该通路可影响甲状腺功能及胰岛素抵抗，进而调控炎症反应，介导心肌凋亡过程。PI3K/Akt通路在甲亢大鼠中磷酸化水平明显降低，上调其磷酸化水平，促使其激活可促进甲状腺正常功能的恢复，抑制炎症发生，降低心肌细胞凋亡比例，改善胰岛素抵抗，其作用机制可能是通过调节细胞因子TNF-α、IL-6的合成分泌影响炎症反应，进而介导甲亢大鼠胰岛素抵抗，但本研究未进行细胞实验验证该过程，且细胞因子TNF-α、IL-6调节胰岛素抵抗的具体分子机制也未进行探讨，存在不足，需要后续的深入研究。