手性功能化的整体柱在毛细管电色谱手性分离中的应用研究进展

张 柳 杜迎翔*

(1. 中国药科大学 药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京 210009；2. 中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009)

毛细管电泳技术是1990年发展起来的集高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)特点于一体的杂交技术[1]。毛细管电色谱(CEC)结合了电驱动分离与多元手性固定相(CSP)的高分离选择性的特点，色谱和电泳机制同时运作。目前，毛细管柱主要分为三种：毛细管开管柱、毛细管填充柱和毛细管整体柱。

其中，整体柱是通过单步或多步共聚反应制备的，具有可调节孔径、高流体渗透率、低背压、多种功能单体和表面化学性质等特点[2，3]。众所周知，对于任何手性分离，选择最合适的CSP对于对映体分离是至关重要的。目前，不同类型的手性选择剂已成功地应用于不同类型化合物的手性分离。其中，以β-环糊精(β-CDs)、生物材料、多糖、奎宁和大环类抗生素为主。

1 环糊精(CDs)

CDs是一类重要的手性选择剂(CS)，是由α-1, 4-糖苷键连接的吡喃葡萄糖单体组成的环状寡糖，其中α-、β-和γ-CDs是三种天然存在的CDs，可用于多种分子的对映体拆分。β-CDs及其衍生物由于具有价廉、CDs-溶质配合物可快速平衡、高效和可获得较好的峰对称性等优点[4]，在CEC方面得到了广泛的关注和应用[5-11]。

由于纳米颗粒(NP)较大的比表面积可以提高对映体的分离选择性，CD修饰的金纳米粒子(CD-GNP)通过共价键合到硫代聚合物上形成的多孔整体柱可用于CEC对映体的分离[12]。该柱对于佐匹克隆、氯苯那敏和托吡卡胺三对药物对映体有着良好的分离效果，各对映体的保留时间、峰面积和Rs的相对标准偏差分别小于1.8%、4.5%和4.4%。该柱在4 ℃ 条件下保存一个月以上，仍具有良好的重复性和对映体选择性。

Khadka和El Rassi[13]合成了一种具有亲水性液相色谱(HILIC)机理的毛细管整体柱，该柱由甘油或多胺羟丙基-β-CD(HP-β-CD)功能化制备而成。该毛细管柱性能稳定，能同时分离对映异构体和位置异构体。虽然巴比妥和华法林对映体只实现部分分离，但苯丙氨酸可达到较好的手性拆分。

2 蛋白质

蛋白质由于其与分析物在不同的微环境条件下具有独特的相互作用(如手性或亲和选择性)而成为一类很有前途的整体性手性固定相(MCSP)材料。整体柱和蛋白质两者结合进行对映体分离可以克服蛋白质紫外吸收强、蛋白质损失大、重现性差等缺点。然而，目前仅有少数蛋白质被用作CS，其中研究最多的用于修饰整体柱的蛋白是人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、胃蛋白酶(pepsin)和α-酸性糖蛋白(AGP)。

Lu等人[14]将BSA共价键合到硅胶上用于合成整体柱手性固定相，所制备的BSA-GNPs-硅胶整体柱在18 min内成功地分离了10对苯硫氨基甲酰氨基酸(PTC-D/L-AAs)对映体。结果表明，以NP为基础的手性固定相为维持BSA的构象和获得良好的手性分离能力提供了一个合适的微环境。由于纳米材料在手性识别过程中具有独特的优势，将毛细管硅胶整体柱和NPs结合起来进行手性分离可能代表了进一步研究的潜在趋势[15-18]。

利用氨基修饰的介孔氧化硅纳米粒子(NH2-MSN)，Xu等人[19]制备了一种poly(GMA-EDMA-NH2-MSN)基质柱，之后以pepsin为CS，对基质柱进行表面功能化处理。由此制备成的整体柱被用于15种基本手性药物的对映体分离，其中9种药物实现基线分离，6种药物部分分离。并且与未添加NH2-MSN的整体柱相比，含NH2-MSN的整体柱显著提高了对所有分析物的手性分离选择性。此外，Miao等人[20]将pepsin固定在羧基化单壁碳纳米管(c-SWNTs)修饰的poly (GMA-co-EDMA)整体柱表面，可用于10种基本手性药物的拆分。

将两种CS即HSA和纤维素同时修饰在同一个poly (GMA-co-EDMA)基质柱上所得的整体柱同样可用于CEC手性拆分[21]。在pH 7的磷酸盐缓冲溶液和有机溶剂(MeOH、iPrOH或ACN)存在的条件下，美托洛尔、比索洛尔、氮泽斯汀、艾司洛尔、华法林和色氨酸均能实现基线分离。但用单一CS制备的整体柱效果不如两种CS共同修饰的整体柱，虽然也能获得良好的手性拆分，但会出现峰展宽的情况。此外，该课题组[22]还通过原位共聚合席夫碱(SNW-1)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和二甲基丙烯酸乙酯(EDMA)制备了一种新型的基质柱，然后将纤维素酶与该基质柱进行共价连接。该工作考察了SNW-1浓度、纤维素酶固定化所用pH值和CEC条件对分离结果的影响。通过条件优化，7对不同类型的手性药物可以实现基线分离，包括β-阻滞剂、抗组胺药物和抗凝血药物。

3 大环类抗生素

目前应用最广泛的大环类抗生素CS有万古霉素、去甲万古霉素、红霉素、阿奇霉素和替考拉宁。这些CS具有不同的手性中心以及空腔、苯环、吡喃糖、呋喃糖、喹啉和噻唑环、供氢体和受氢体、糖基等基团，因此在不同色谱条件下具有良好的手性选择性。

据报道，通过大环抗生素与四甲氧基硅烷(TMOS)原位共聚，利用酸催化的溶胶-凝胶反应可制备一种新型万古霉素功能化的三维骨架的整体柱[23]。与后修饰的方法相比，一步法的步骤较少，同时也增加了配体负载量。结果表明该柱在反相色谱条件下对β受体阻滞剂具有良好的手性识别性能，而采用后修饰法合成的万古霉素硅胶整体柱则无法获得同样的拆分效果。

以红霉素为CS，Dixit等[24]制备了杂化毛细管整体柱。这种柱子集合了有机整体柱和无机整体柱的优点，对pH、有机溶剂和温度具有高度稳定性，具有高传质和高渗透性等优点。实验通过溶胶-凝胶法使氧化锆与红霉素的3-三乙氧基甲硅烷丙氨基甲酰化衍生物反应。一些碱性化合物(普萘洛尔、西替利嗪、西酞普兰、美托洛尔、舍曲林和吲达帕胺)能够达到有效分离，Rs范围在2.17～3.34之间。该柱重现性好，在pH 11.0时也具有良好的稳定性。

4 离子交换试剂

在CEC中常用的另一类CS是基于离子交换机制的选择剂，利用离子间的相互作用力将分析物引向CS的结合位点。其中奎宁、奎宁氨基甲酸酯、奎尼丁衍生物以及磷酸盐、磺酸盐等离子交换剂的应用最为广泛。

Buchinger等人[25]使用O-9-(叔丁基氨基甲酰基)奎尼丁为选择剂的整体柱拆分了双氯丙酸、非诺普和异丙酚除草剂对映体。结果表明该方法具有良好的拆分能力、样品装载量、塔板数和峰对称性。

Tran和Park[26]利用采用溶胶-凝胶法制备了一种由弱阴离子交换剂(奎宁)修饰的氧化锆所制备的杂化整体柱。该柱在pH大于9.0时呈现阴极向电渗流(EOF)，pH小于9.0时为阳极向EOF，并对衍生化氨基酸(N-3, 5-二硝基苯甲酰基亮氨酸和苯甘氨酸)和一些酸性化合物(布洛芬、氟比洛芬、卡洛芬、酮洛芬、苏洛芬、扁桃酸)等对映体实现了基线分离。

5 配体交换试剂

手性配体交换色谱法涉及到配体和对映体在金属离子上的交换，配体交换基于配合物的金属离子，配体和对映异构体之间配位键的断裂和形成。因此，含有给电子原子如氧、氮和硫的外消旋体可以在这些类型的CSPs上成功分离。最常用的CS是交联聚苯乙烯树脂和含有手性氨基酸的聚丙烯酰胺，以及在聚苯乙烯型基质中含有L-脯氨酸的树脂。

配体交换手性色谱法适用于给电子消旋体的拆分。有研究采用“一锅法”设计了一种新的氨基酸表面活性剂为基础的CEC整体柱体系[27]，利用优化后的整体柱对(±)-伪麻黄碱(PEP)和(±)-麻黄碱(EP)同时进行对映体拆分，并考察了氨基酸表面活性剂在手性识别过程中的作用。

Denizli等人[28]使用另一种氨基酸类的手性单体，即N-甲基丙烯酰-L-组氨酸甲酯(MAH)，制备了手性聚合物整体柱，采用CEC法成功分离了多种芳香胺类化合物，包括D/L-苯丙氨酸、D/L-酪氨酸和D/L-色氨酸。随着MAH浓度的增加，α逐渐增大，表明这种新的氨基酸CS可以有效地用于对映体识别。

6 多糖

关于多糖这类CS，他们主要是基于直链淀粉或纤维素的手性特性提供立体选择性相互作用。多年来，通过引入氨基甲酸苯酯基团对这两种CS进行了改性处理，苯环进一步被氯、氟、甲基、溴等取代基修饰[29]。这些基团的存在极大地提高了这种CSP类型的对映体选择性，同时伴随着亲和作用机制。

Lv等人[30]利用纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CDMPC)修饰的MCSP在CEC中手性拆分了一些酸性、中性、双官能团和碱性化合物，包括安息香、吲达帕胺、特罗格碱、安布西胺、奥沙西泮、华法林和氯灭鼠灵。

在最近的一项研究报道中[31]，CDMPC被涂覆在一个甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)组成的整体柱上，并与一个带正电荷的单体进行光催化反应。实验研究了光催化反应和CS涂覆工艺，确定了最佳实验条件。随着带电单体含量的增加(1.5～7.5 wt%)，EOF也随之增加，最终实现了2-苯基-1-丙醇，特罗格碱和布洛芬的手性拆分。

此外，Sun等[32]采用纳米级直链淀粉-2, 3-二(3, 5-二甲基苯氨基甲酸酯)(nano-ABDMPC)和nano-ABDMPC-二氧化硅修饰的杂交整体柱分离了6对对映体苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯乙醇、1-苯基-2-丙醇和特罗格碱。

7 分子印迹聚合物(MIP)

MIP是由模板分子、功能单体、交联剂和引发剂组成的混合物在非极性溶剂(致孔性溶剂)中聚合而成的。聚合后，通过溶剂萃取可除去模板分子，从而留下具有模板分子形状的三维空腔。功能单体和交联剂的种类和用量、功能单体与模板分子的摩尔比、多孔溶剂的种类等是影响MIP-CSP对映体选择性的重要因素[33]。

有研究报道[34]以模板分子D-佐匹克隆(D-ZOP)、甲基丙烯酸(MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为原料，合成了MIP毛细管柱，并通过CEC分离了佐匹克隆对映体。该研究考察了温度、缓冲液浓度、聚合条件等因素对实验的影响。

由于受到带有支链大分子结构的启发，Song等人[35]以S-氨氯地平为模板分子，八乙烯基修饰的多面体低聚倍半硅氧烷(Ov-POSS)为交联剂，甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，制备了新型MIP整体柱。结果显示氨氯地平的分离结果得到明显改善，该柱具有良好的稳定性和重复性。然而，一种MIP合成法仅适用于一种手性化合物的分析，效率低且有效性差，这可能也是其在CE应用中有局限性的原因。

8 小结与展望

近年来，整体柱越来越受欢迎，具备一定的吸引力，由于其制备简单、几乎无限制的化学试剂选择，而且不存在熔块煅烧及其造成的后续问题，整体柱已成为CEC毛细管填充柱有力的替代方案。在CEC中，新型固定相的开发一直是研究的重点。随着材料科学的发展，相继出现了大量的创新材料，如金属有机骨架(MOFs)、共价有机骨架(COFs)、多孔有机笼(POCs)、针织芳香族聚合物(KAPs)和深共熔溶剂(DESs)。然而，到目前为止，这些材料在MCEC对映体分离的应用还很少。因此，CEC作为一种先进的分析技术，具有巨大的发展潜力。

此外，目前的研究主要集中在手性化合物的色谱分离方面，而在实际样品分析中的应用较少。实际上，随着环境、食品工业和生物分析研究前沿的快速发展，对毛细管电泳应用于实际样品分离的需求日益迫切。未来的发展有望继续探索新的高效手性改性材料，提高CEC分析实际样品的能力。总的来说，整体柱在CEC领域的应用仍然是一个很有前途的分离科学研究方向。