4-羧基苯硼酸改性壳聚糖-羟基磷灰石吸附维生素B12

李叶惠 李晓宁 王 祥 王海军

(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

维生素B12是一组类皮质醇化合物，属于天然抗氧化剂，其作为辅酶在促进碳水化合物和正常脂肪代谢中起重要作用、同时它在红细胞形成、神经系统的正常工作和甲基的易位方面也发挥重要作用。然而，由于维生素B12多由菌类发酵生产，具有杂质种类多，含量低的缺点，其分离纯化具有挑战性。

本研究拟通过结合固相萃取和浊点分离，建立一种新型且生态友好的维生素B12分离纯化工艺。通过对壳聚糖加载量，pH及吸附时间等因素进行考察，对其吸附行为进行研究。并通过浊点分离对维生素B12进行纯化。为更经济、环保、实用的分离和纯化维生素B12提供了新的方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

维生素B12发酵液由华北制药有限公司提供；维生素B12标准品，色谱级，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱级，美国Sigma公司；四水硝酸钙，磷酸氢二钠，脲，壳聚糖，4-羧基苯硼酸，硼氢化钠，磷酸氢二钾，苯六酸，乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。

HR-200分析天平，广州市艾安得仪器有限公司；DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器，常州市伟嘉仪器制造公司； TU-1950紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；KQ-500D台式数控超声清洗仪，东莞市科桥超声波设备有限公司； Ultimate 3000 RS超高效液相色谱仪，Nicolet iS50 FT-IR傅立叶红外光谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；D2 PHASER X射线衍射仪，德国布鲁克AXS有限公司。

1.2 吸附剂的制备

1.2.1 壳聚糖-羟基磷灰石(CS/HAP)的制备

将1.5 g壳聚糖、1.416 g四水硝酸钙和1.288 g磷酸氢二钠完全溶解于60 m去离子水中，保证Ca/P=1.67，滴加适量硝酸使得pH=2.5。将0.126 g苯六酸和2 g脲加入溶液中，并在实验下搅拌30 min，然后将溶液转移至衬有聚四氟乙烯的高压反应釜，并在150 ℃下保温5 h。冷却至室温后，用去离子水和无水乙醇冲洗3次，然后放入80 ℃真空干燥箱中干燥24 h[1]。

1.2.2 4-羧基苯硼酸改性壳聚糖-羟基磷灰石

将1.50 g4-羧基苯硼酸(CPBA)溶于30 mL 0.1 mol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液。然后加入2.97 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2.97 g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在40 ℃下活化羧基45 min，然后冷却至室温。随后，用0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液将上述溶液pH调至7.0。将0.3 g的CS/HAP混合物添加到混合溶液中超声分散处理5 min后室温搅拌5 h，所获得的CPBA-CS/HAP通过减压抽滤收集，并用去离子水和二甲基甲酰胺各洗涤三次。最后将CPBA-CS/HAP置于真空干燥箱80 ℃真空干燥24 h。

1.3 吸附剂的表征方法

1.3.1 傅里叶红外光谱仪(FT-IR)

将材料放在80 ℃的真空干燥箱中干燥12 h后，取约为样品量50倍的KBr混合研磨均匀后进行固体压片，通过FT-IR分析其结构，扫面范围为4000～400 cm-1。

1.3.2 X射线衍射仪(XRD)

材料的晶化状况由X射线衍射仪进行分析，测试条件为：扫描范围5～80°，扫描速度5°/min，Cu靶辐射，光管功率为2.2 kW。

1.3.3 热重分析(TGA/DTG)

采用瑞士梅特勒-托利多1100SF型热重分析仪对HAP和HAP/CS进行测量，分析其质量与温度的关系。测试条件为以氮气为载气，流量30 mL/min，升温速率10 ℃/min，升温范围为50～800 ℃。

1.3.4 全自动比表面积及微孔物理吸附仪(BET)

4-羧基苯硼酸改性后壳聚糖/羟基磷灰石的比表面积、孔容和孔径通过美国麦克仪器公司ASAP2020 MP进行分析，样品处理方法为在真空条件下，80 ℃干燥24 h后于120 ℃脱气6 h，其表面积通过BET方程计算，孔容和孔径通过BJH算法得到。

1.4 绘制标准曲线

精确称量25 mg的维生素B12标准品，用去离子水溶解并定容至25 mL，得到1 mg/mL的标准储备液。量取1、2、3、4、5 mL的标准储备液置于10 mL具塞试管中，用去离子水定容至10 mL，配制为100、200、300、400、500 μg/mL的测试液，并利用紫外-可见分光光度计确定最大吸收波长并绘制标准曲线，紫外扫描范围为200～600 nm，最大吸收波长为355 nm，标准曲线方程为y=0.002 02x+0.006 9，R2=0.999 36，线性范围0～500 μg/mL。

1.5 不同材料对维生素B12吸附的影响

0.1 g商用大孔树脂(MR)、0.1 g粉末活性炭(AC)、壳聚糖(CS)、羟基磷灰石(HAP)、未改性壳聚糖/羟基磷灰石(CS/HAP)、4-羧基苯硼酸改性壳聚糖/羟基磷灰石(CPBA-CS/HAP)与200 mL初始浓度为1 mg/mL的维生素B12溶液混合均匀，在25 ℃下磁力搅拌吸附12 h后，在8 000 r/min离心15 min后，取上清液测定其在355 nm处的吸光度，用公式(1)计算CPBA-HAP/CS对维生素B12的吸附量Q。

Q=(Co-Ce)*V/Wo

(1)

其中Q为维生素B12吸附量，Co为吸附液初始浓度，Ce为吸附后吸附液浓度，V为吸附液体积，Wo为吸附剂质量。

1.6 不同pH下维生素的B12的吸附实验

为了研究CPBA-HAP/CS在不同pH条件下对维生素B12的吸附性能，将一定量的CPBA-HAP/CS粉末(0.1 g)与200 mL初始浓度为1 mg/mL的维生素B12溶液混合均匀，利用HCl和NaOH将溶液pH分别调至5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2，在25 ℃下磁力搅拌12 h后，在8 000 r/min离心15 min后，取上清液测定其在355 nm处的吸光度，用公式(1)计算CPBA-HAP/CS对维生素B12的吸附量Q。

1.7 不同时间下维生素B12的吸附实验

为了研究吸附时间对吸附量的影响和CPBA-HAP/CS的平衡吸附量，将一定量的CPBA-HAP/CS粉末(0.1 g)与200 mL初始浓度为1 mg/mL的维生素B12溶液混合均匀，在25 ℃下磁力搅拌吸附不同时间(30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390 min)。吸附完成后，在8 000 r/min离心15 min 后，取上清液在355 nm处测定吸光度，用公式(1)计算CPBA-HAP/CS对维生素B12的吸附量，并对吸附结果进行拟合。

2 结果与分析

2.1 吸附剂的表征

2.1.1 FT-IR分析

红外光谱如图1所示，其中3 436 cm-1处的吸收峰与O-H和N-H的拉伸振动有关。2 912 cm-1处吸收峰为壳聚糖的吡喃糖环，600 cm-1,563 cm-1,465 cm-1的吸收峰归因于HAP中O-P-O的弯曲振动，956 cm-1和1 029 cm-1处吸收峰为HAP中O-P伸缩振动。由曲线a可以看出在1 380 cm-1，1 076 cm-1处出现新的吸收峰为B-O的伸缩振动和C-B的拉伸振动。

图1 CPBA-HAP/CS(a)、HAP-CS(b)、CS(c)、HAP(d)的红外光谱Fig. 1 Infrared spectrum of CPBA-HAP/CS(a)、HAP-CS(b)、CS(c)、HAP(d)

2.1.2 XRD分析

在2θ=25.8、31.7、32.1、32.8、33.9、39.8、46.6、49.3°呈明显的晶体衍射峰且与标准卡片(JCPDS编号72-1243)一致，这表明所制备的固体为六边形HAP。同时在HAP/CS的图像中出现了2θ=20°的CS特征峰，这说明复合物已经被成功制备而不是原料的单纯混合。比较CPBA-HAP/CS和HAP/CS的XRD图谱(图2)，发现4-羧基苯硼酸的官能化对于HAP部分的晶格没有明显变化，但CS的结晶度明显降低，这说明4-羧基苯硼酸是接在了壳聚糖上。

图2 CPBA-HAP/CS(a)、HAP/CS(b)、HAP(c)和CS(d)的XRD图Fig. 2 XRD of CPBA-HAP/CS(a)、HAP/CS(b)、HAP(c)and CS(d)

2.1.3 TGA分析

羟基磷灰石具有相当好的热稳定性，在110 ℃ 左右出现轻微失重，这与材料物理吸附的水分子有关，材料本身未出现明显热解行为。CPBA-HAP/CS的热稳定性较差，这主要是因为壳聚糖在高温下易分解。110 ℃时0.85%的失重是由水分蒸发引起的，在230 ℃～450 ℃的失重与壳聚糖的分解有关。

2.1.4 N2吸附-脱附分析

通过全自动比表面积及微孔物理吸附仪(BTE)对HAP以及CPBA-HAP/CS的结构进行分析，N2吸附-脱附等温线如图3所示。从图中可以看出在整个相对压力范围内，吸附-脱附等温线为Ⅳ型，说明吸附剂是一种介孔结构[2]。

图3 N2吸附-脱附等温线Fig. 3 N2 adsorption desorption isotherm

2.2 不同材料对维生素B12吸附量的影响

研究不同材料对维生素B12的吸附，结果表示4-羧基苯硼酸改性壳聚糖-羟基磷灰石材料吸附量为30.47 mg/g,其中商用大孔树脂为10.6 mg/g。

2.3 不同pH对维生素B12吸附量的影响

由图4可见，维生素B12的吸附量在pH=6.2时达到最大，pH=5.4时吸附量的明显减少是因为壳聚糖/羟基磷灰石在酸性条件下容易溶解。

图4 不同pH对维生素B12吸附量的影响Fig. 4 Effect of different pH on adsorption capacity of vitamin B12

2.4 不同时间对维生素B12吸附的影响

由图5可见，维生素B12的吸附量随时间的增加而增加，在360 min达到平衡。

图5 不同时间对维生素B12吸附的影响Fig. 5 Effect of different time on vitamin B12 adsorption

3 结论

本研究开发了一种苯硼酸改性壳聚糖-羟基磷灰石，有效地从维生素B12原液中特异性吸附维生素B12。以苯硼酸改性壳聚糖/羟基磷灰石复合材料(CPBA-CS/HAP)为吸附剂，在pH=6.2，溶液浓度为1 mg/g，吸附时间为360 min的条件下，最大吸附量为42.6 mg/g。