基于血液DNA甲基化在肝癌诊断中的研究进展

李芳芳, 陶紫薇, 沈永利, 翁亚丽

(南京医科大学第一附属医院 感染病科, 江苏 南京, 210029)

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在癌症致死病因中高居第3位，世界卫生组织(WHO)预测2030年将有100万人死于肝癌[1]。据统计，超过一半新发和死亡患者在中国[2]。肝癌的主要危险因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染，丙型肝炎病毒(HCV)感染，酒精摄入及代谢综合征[3]。巴塞罗那肝癌分期系统(BCLC)是目前应用最为广泛的分期系统，该方案将肝癌的临床分期分为最早期、早期、中期、晚期和终末期，并为每个阶段提供治疗建议[1]。早期诊断是改善肝癌预后的重要方式。欧洲肝脏协会对于非肝硬化患者，或者经影像学不能诊断为肝癌的肝硬化患者，推荐通过病理来确诊肝癌[3]，但穿刺活检会发生出血及肿瘤针道转移等风险。此外，肝癌是最具异质性特征的肿瘤之一，因此单一的病灶活检并不能代表整个肿瘤病变的异质性[4]。目前，肝癌的主要血液学标志物仍然是甲胎蛋白(AFP)，但其诊断肝癌的敏感度和特异度均难以满足临床需求，约30%肝癌患者血清AFP值可处于正常范围值内[5]。液体活检是诊断肿瘤的一种非侵入式无创检测技术，主要检测原位肿瘤或转移灶释放到体液中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环游离DNA(cfDNA)及循环微小核糖核酸(miRNA)。健康人群中, cfDNA主要来源于凋亡细胞，而肿瘤患者中的cfDNA主要由肿瘤来源的DNA组成。研究[6-9]显示, cfDNA在诊断肝癌及预测肝癌预后方面具有潜在价值。DNA甲基化是一种表观遗传学的基因修饰形式，异常的基因甲基化被认为是引发肝癌的主要机制之一[10-11]。一项研究[12]表明，通过甲基化反卷积分析，肝癌患者肝脏释放入血浆的DNA中位百分比显著高于对照组(分别为24%和11%)。本文就cfDNA甲基化研究现状及其作为肝癌生物标志物方面的最新进展进行综述。

1 DNA甲基化标志物在肝癌及其他癌症

检测中的现状

引起癌症的基因突变种类繁多[13]，即使在同一种肿瘤类型中，不同患者的突变谱也不尽相同。SCHULZE K等[14]表明突变影响端粒酶逆转录酶(TERT)启动子、钙黏蛋白相关蛋白β1(CTNNB1)和肿瘤抑制因子p53(TP53)等多种基因。基因突变的多样性给基于DNA序列变化的癌症诊断带来了难度。与基因突变相比，癌症中DNA甲基化变化具有稳定性，有可能成为生物标志物开发的一个有前景的新靶点。MONTAVON C等[15]发现HOXA9启动子和EN1启动子分别在95%和80%的卵巢癌患者中甲基化。DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的反应，作为表观遗传学水平基因表达的核心机制，DNA甲基化在肝癌发生中起重要作用[11，16-17]。ZHANG C等[18]对144项病例对照研究进行了荟萃分析并得出结论，异常的DNA甲基化可能成为预测和诊断肝癌的有效生物标志物，并且证实了RAS相关结构域家族1A(RASSF1A)、谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)、p16等异常甲基化基因与肝癌的发生密切相关。肿瘤的发展一般伴随着原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化[19], 血液中也可以检测到类似的变化，这表明基于血液的DNA甲基化标志物可作为新的筛查标记或危险分层的标记[20]。近10年，针对cfDNA甲基化的研究数量逐年递增。研究[21]通过大数据分析循环游离DNA甲基化，构建出了一种分类器，能够识别出血液样本中肿瘤来源的DNA，并且完成肿瘤分类。外周血中SEPT9甲基化已被美国食品药品监管管理局(FDA)批准用于结直肠癌的检测, PRESEPT研究[22]显示mSEPT9检测结直肠癌的敏感度为48.2%, 特异度为91.5%。LIGGETT T E等[23]通过分析3组队列病人的血浆样本cfDNA基因甲基化模式，区分出健康个体和良性、恶性卵巢肿瘤患者，且均具有很高的敏感度和特异度。因此，基于血液的DNA甲基化能够成为诊断肝癌的可靠的非侵入性方法。

2 cfDNA甲基化标志物在肝癌诊断中

的作用

2.1 单个DNA甲基化标志物检测

DNA甲基化作为最常见的表观遗传修饰，已被报道其会影响肝癌的基因组稳定性和肿瘤抑制基因的转录沉默[24-28]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(CDKN2A)是一种被广泛接受的肿瘤抑制基因; 1999年, WONG I H等[29]首次在肝癌患者血浆和血清中发现CDKN2A(编码p16的基因)启动子高甲基化，其主要利用DNA甲基化特异性的聚合酶链式反应(PCR), 分析了肿瘤相关p16基因在肝癌患者中的甲基化状态，结果发现73%(16/22)的肝癌组织中出现p16基因异常甲基化，在这16例患者中, 81%(13/16)的患者血液中也检测到类似的甲基化改变。一项旨在评价体液(血清、血浆和全血)中RASSF1A启动子甲基化诊断肝细胞癌(HCC)效能的荟萃分析[30], 纳入了302例肝癌患者和250例慢性肝病患者，结果显示RASSF1A启动子甲基化诊断肝细胞癌的敏感度和特异度分别为0.70(95%CI: 0.49～0.85)和0.72(95%CI: 0.54～0.85), 受试者工作曲线下面积(AUROC)为0.77(95%CI: 0.73～0.81)。一项研究[31]评估了血浆中SEPT9启动子甲基化(mSEPT9)诊断肝癌的效能，共计纳入104例肝癌患者及174例健康人群，结果表明mSEPT9启动子甲基化在鉴别诊断肝癌组与健康对照组时，敏感度为82.7%, 特异度为96.0%, AUROC为0.961(95% CI: 0.933～0.989), 显著优于AFP(AUROC 为0.881, 敏感度为57.7%, 特异度为 98.3%)。此外，研究者进一步将肝癌患者按照BCLC分期进行分期，早期组包括A期及B期患者，共73例; 发现mSEPT9用于诊断早期肝癌患者同样具有较高的诊断价值(AUROC为0.946, 95%CI: 0.907～0.985, 敏感度为76.7%, 特异度为96.0%)。

其他单基因标志物研究[32-38]表明，GSTP、TBX2、FHIT、SCAND3、SOX1、VIM、SOCS3、SGIP1等单个基因的高甲基化在肝癌的检测中具有潜在临床价值。TIAN M P等[32]发现血液中的GSTP启动子高甲基化与HCC的发病率呈正相关，且其与苯并芘(一种化学致癌物)的肝细胞毒性密切相关; WU H C等[33]发现血液中的TBX2高甲基化与HCC风险增加相关; IYER P等[34]发现肝癌患者血液中FHIT甲基化频率明显增高。

此外, DNA低甲基化可激活原癌基因，促进肿瘤的发生发展[39-40]。有研究者采用DNA低甲基化作为诊断肝癌的标志物，并取得了较好的结果。RAMZY I I等[41]发现肝癌患者血清中LINE-1的低甲基化概率显著高于对照组。CHAN K C等[42]使用鸟枪法大规模并行亚硫酸盐测序方法对血浆中全基因组的低甲基化分析，发现其是检测肝癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、平滑肌肉瘤和神经内分泌癌等多种癌症的有效方法。在肝癌的诊断中, AUROC为0.96(95%CI: 0.91～1.00), 但是其检测方法较为复杂，有待进一步简化。

DNA甲基化与肝癌的发生、发展有着密不可分的关系，大部分关于肝癌的DNA甲基化研究都集中于高甲基化。以上研究结果提示，单基因高甲基化在肝癌的诊断方面可能比AFP更具敏感度和特异度，并有望成为肝癌的有效的新型血液学生物标志物。

2.2 多个DNA甲基化标志物联合检测

近年来，研究证明使用多基因甲基化标志物联合检测肝癌能够显著提高诊断效能。WEN L等[43]利用一种甲基化CpG短串联扩增与测序技术(MCTA-Seq)检测肝癌患者、肝硬化患者及正常人的血浆样本中的肿瘤特异度CPG岛，共鉴定出2种类型的标志物用于肝癌的诊断。Ⅰ型标志物(RGS10、ST8SIA6、RUNX2和VIM)具有高特异度; Ⅱ型标志物[TMC8(i)、SCT、TBX2等15个基因]在肝癌发生早期即可释放入血，具有高敏感度。此项研究中, 2种类型标志物的联合检测对HCC患者、肝硬化患者及健康人群的诊断敏感度达94%, 特异度达89%, 并且成功诊断15例AFP阴性的HCC患者，该研究表明多种DNA甲基化的联合检测有望提高AFP阴性的肝癌患者的诊断效能，但需要扩大样本量进一步验证。

一项纳入1098位肝癌患者及835位健康人群的大型研究[44], 成功筛选出用于检测肝癌的10个甲基化标志物(BMPR1A、PSD、ARHGAP25、KLF3、PLAC8、ATXN1、Chr 6∶170、Chr 6∶3、ATAD2及Chr 8∶20), 其在训练队列对HCC诊断的敏感度为85.7%, 特异度为94.3%, 在验证队列中诊断的敏感度为83.3%, 特异度为90.5%。并证实了该诊断模型与肿瘤负荷、治疗应答、肿瘤分期均相关。KISIEL J B等[45]利用简化代表性重亚硫酸盐测序鉴定出27个候选基因。Ⅱ期临床研究中纳入了95例HCC患者, 51例肝硬化患者和98例健康对照人群，发现其中6个循环游离DNA甲基化标志物(HOXA1、EMX1、AK055957、ECE1、PFKP和CLEC11A)联合检测HCC的敏感度为95%, 特异度为92%; 该基因panel能够检测出75%(3/4)的0期肝癌患者和93%(39/42)的A期肝癌患者(BCLC分期); 此研究中基因panel诊断肝癌效果显著优于AFP(P<0.001)。

上述研究证明，联合诊断的模型与肝癌的分期相关，且在诊断早期肝癌(如BCLC分期0和A期)仍有较高的准确度。因此，多个DNA甲基化联合是可靠的无创生物标志物，对于早期发现肝癌有重要意义。

2.3 DNA甲基化标志物联合AFP

近年来，新型标志物联合AFP诊断肝癌已表现出极大的优势。TIAN M M等[46]检测350份血清样本的HCCS1启动子甲基化及AFP水平，发现两者联合对诊断HBV相关性肝癌的敏感度达81.7%, 显著高于AFP单独检测。DONG X Y等[47]纳入了HBV相关性肝癌患者98例，肝硬化患者75例，慢性乙型肝炎患者90例及健康对照80例，检测血清中多种基因甲基化水平，结果显示RASSF1A、BVES及 HOXA9三种基因panel联合AFP, 其诊断HBV相关性肝癌的敏感度为83.7%, 特异度为78.9%, AUROC达0.852。学者[48-49]认为HBV相关性肝癌的发病机制涉及表观遗传学，尤其是DNA甲基化，且血液中游离的甲基化基因的动态变化特征与HBV相关性肝癌的发展过程有相关性，上述研究结果再次证实了此观点。有学者[50-51]证明了DNA启动子甲基化参与了慢性丙型肝炎向肝癌的发展过程，且DNA甲基化联合AFP对HCV相关性肝癌也有良好的诊断效能。基于DNA甲基化联合AFP在HBV相关性肝癌及HCV相关性肝癌的诊断中的效能，表明检测血液中的游离DNA甲基化对肝癌的病因诊断有一定的帮助，但需要继续研究来证实。

血液中基因甲基化水平联合AFP对早期肝癌的诊断显示出一定的临床应用前景。一项多中心病例对照研究[52]发现, 3个DNA甲基化标志物(HOXA1、EMX1 及 TSPYL5)联合AFP、AFP-L3诊断早期肝癌，特异度达90%, 敏感度为71%, 这与PASHA H F等[53]研究结果相似。

2.4 DNA甲基化标志物联合其他指标

ZHANG Y J等[54]检测50例肝癌患者与50例健康对照的血清中3种DNA甲基化水平(RASSF1A、p16和p15), 并将这3种基因标志物联合患者临床特征，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、表面抗原及丙型肝炎病毒抗体等，建立一种诊断模型，该模型对肝癌的诊断敏感度为84%, 特异度为94%, 提示DNA甲基化联合其他指标，如异常凝血酶原(PIVKAII)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、患者的临床指标、影像学资料(如肝脏超声)等，可提高肝癌的检出率。

3 结语与展望

肝癌是一种高发病率及高致死率的疾病，其发生、发展是表观遗传学不断积累变化的过程[55]。DNA甲基化是转录和调控控制的重要表观遗传学改变，是表观基因组领域最有前途的生物标志物，可以根据直接从肿瘤或“偏远”位置(如痰、血液、尿液及胆汁等)获得的遗传物质进行诊断[56-57]。本文综述了基于血液的DNA甲基化检测在诊断肝癌方面的进展，着重介绍了单个DNA甲基化标志物、多个DNA甲基化标志物联合及DNA甲基化联合AFP在肝癌检测方面取得的现有成果。随着检测技术的不断进步，以DNA甲基化为基础的液体活检的临床效能，需要高质量研究进一步验证。期待在不久的将来，基于血液的无创检测方法检测患者的相关基因位点异常甲基化，能够成为肝癌早期诊断、长期监测、预后判断以及指导个性化用药的重要手段。