葡萄籽原花青素抗衰老作用的研究

方欢乐，于晋茹 ，陶炎炎 ，张 慧，刘建利

（西安培华学院 医学院，陕西 西安 710125）

目前，随着老年人口的迅速增加[1]，衰老相关疾病发病率也在不断增长[2]。生物体的衰老过程主要表现为机体组织和细胞中自由基累积。自由基是正常代谢的中间产物，其反应能力强，可使细胞中多种物质发生氧化，损害生物膜，还可引发DNA的损伤，进一步诱发肿瘤等疾病。随着年龄的增长，人体的自由基防御能力减弱。

葡萄籽的提取物葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）具有增强心血管活性、抗氧化、抗衰老等多种生物活性和药理作用[3]。GSPE用于食品中能有效清除体内自由基，防治与自由基相关的心血管等疾病[4]；在化妆品中使用也可使皮肤老化减慢[5]。

研究显示模拟自然衰老过程公认的研究方法是持续注射一定量D-半乳糖[6]。本研究采用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，检测葡萄籽原花青素对衰老小鼠的抗氧化功效，探讨葡萄籽原花青素的抗衰老作用，为其在抗衰老方面的应用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AE224电子天平（上海恒平）；SG-4054恒温水浴锅（上海硕光）；JJ-2高速组织捣碎机（上海净信科技）；XSP-9CA光学显微镜（上海光学仪器一厂）； Varioskan Flash全波长扫描多功能读数仪（美国Thermo Scientific公司）。

1.2 材料

葡萄籽原花青素提取物（GSPE，陕西惠科植物有限公司，纯度大于95 %）；D-半乳糖粉剂（上海国药集团，批号：20061025）；维生素C注射液[华润双鹤利民药业（济南）有限公司，批号：H20023350]；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒，丙二醛（MDA）检测试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒，羟脯氨酸（HYP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20190514）。

1.3 实验动物

雄性昆明种小鼠60只，20～22 g，购自西安交通大学医学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK（陕）2010-001，动物使用许可证号：SYXK（陕）2018-001。温度22±2 ℃，相对湿度55 %±15 %，12 h:12 h暗/光循环条件下饲养。

2 方法

2.1 动物分组及造模给药

健康雄性小鼠60只，适应性饲养7 d，随机分为6组即空白组、模型组、GSPE低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）剂量组、维生素C阳性对照组（100 mg/kg），每组10只。将配制好的D-半乳糖溶液皮下注射于小鼠颈部（0.1 ml/10 g），空白对照组颈部皮下注射等体积的生理盐水，连续注射30 d致小鼠衰老。造模同时各给药组灌胃给予相应浓度的药物溶液，空白对照组和模型对照组给予生理盐水20 ml/kg，每日1次，连续8周。每周称重一次。

2.2 脏器系数测定

末次给药后禁食24 h，称取小鼠体重。眼球取血并分离血清。处死小鼠，摘取肝脏、脾脏、胸腺组织，生理盐水洗净各脏器组织，吸水纸吸干水分后，称重，按下式计算各脏器组织脏器系数。

脏器系数=脏器重量（mg）/小鼠体重（g）

2.3 肝脏、皮肤组织及血清生化指标检测

眼球取血，3500 r/min离心20 min后，分离血清，采用试剂盒测定各组小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px含量。取小鼠肝脏和皮肤组织加入冰浴过的生理盐水制备10 %的组织匀浆2 ml，12 000 r/min 低温离心10 min，分离上清，采用试剂盒测定小鼠血清及肝脏、皮肤组织匀浆液中SOD、MDA、GSH-Px含量。同时检测皮肤组织中羟脯氨酸（HYP）的含量。

2.4 肝脏组织切片观察

取小鼠部分肝脏组织，固定于10 %甲醛溶液中，依次经80 %，90 %，95 %，100 %酒精脱水。石蜡包埋，切片机切片，苏木素-伊红染色，中性树脂封片，显微镜下观察肝脏组织细胞形态的变化。

2.5 数据处理

3 结果与分析

3.1 GSPE对衰老小鼠脏器系数的影响

与正常组小鼠比较，模型组小鼠的脾脏、胸腺系数显著减小，肝脏系数显著增大（P＜0.01）；与模型组比较，GSPE 400 mg/kg组和维生素C组小鼠脾脏、胸腺系数显著增大，肝脏系数显著减少（P＜0.01），200 mg/kg剂量组脾脏系数增大（P＜0.05），而100 mg/kg剂量组3个脏器系数均无明显变化。结果见表1。

表1 GSPE对衰老小鼠脏器系数的影响（n=10，±s）

表1 GSPE对衰老小鼠脏器系数的影响（n=10，±s）

注：**P＜0.01 vs 正常组；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 模型组

肝脏/mg·g-1正常组 - 2.94±0.63 4.12±0.79 34.84±4.52模型组 - 2.07±0.42** 2.72±0.87**43.14±4.93**低剂量组 100 2.09±0.74 2.76±1.14 39.73±8.48中剂量组 200 2.41±0.37# 3.22±0.98 36.32±8.33高剂量组 400 2.66±0.61## 3.97±1.03##35.77±5.52##维生素C 100 2.76±0.33## 4.262±0.61##33.77±3.52##组别 剂量/mg·kg-1脾脏/mg·g-1胸腺/mg·g-1

3.2 GSPE对衰老小鼠血清SOD、MDA、GSH-Px含量的影响

与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，GSPE 400，200 mg/kg剂量组和维生素C组血清SOD、GSH-Px含量升高，MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。100 mg/kg剂量组各指标无明显变化。结果见表2。

表2 GSPE对衰老小鼠血清SOD、MDA、GSHPx含量的影响（n=10，x ±s）

3.3 GSPE对衰老小鼠肝脏SOD、MDA、GSH-Px含量的影响

与正常组小鼠比较，模型小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量明显增加。与模型组相比，GSPE 400 mg/kg组和维生素C组肝脏组织中的SOD、GSH-Px含量均升高，MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）；200 mg/kg组肝脏组织中GSH-Px含量升高，MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。100 mg/kg剂量组各指标无明显变化。结果见表3。

表3 GSPE对衰老小鼠肝脏中SOD、MDA、GSH-Px含量的影响（n=10，±s）

表3 GSPE对衰老小鼠肝脏中SOD、MDA、GSH-Px含量的影响（n=10，±s）

注：**P＜0.01 vs 正常组；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 模型组

正常组 - 140.56±25.58 11.04±1.44 542.00±22.10模型组 - 110.11±24.27**13.85±1.83**400.12±18.10**低剂量组 100 119.56±41.40 12.67±0.86 433.12±18.10中剂量组 200 118.67±25.20 11.69±0.93#483.12±18.10##高剂量组 400 133.11±30.27#11.91±0.86##533.12±18.10##维生素C 100 140.22±16.21##11.75±1.36##538.12±15.10##

3.4 GSPE对衰老小鼠皮肤组织中SOD、GSH-Px、HYP含量的影响

与正常组小鼠比较，模型组小鼠皮肤组织中SOD、GSH-Px含量降低，HYP含量明显增加。与模型组相比，GSPE 400 mg/kg组和维生素C组小鼠皮肤组织中的SOD、GSH-Px含量升高，200 mg/kg组小鼠皮肤组织中HYP含量降低，GSH-Px含量升高（P＜0.05，P＜0.01），HYP含量降低（P＜0.01）。100 mg/kg剂量组各指标无明显变化。结果见表4。

表4 GSPE对衰老小鼠皮肤组织中SOD、GSHPx、HYP含量的影响（n=10，x ±s）

3.5 GSPE对衰老小鼠肝脏组织切片观察分析

组织病理学结果见图1。由图1可见，正常组肝细胞排列紧密，细胞形态正常；模型组肝细胞扩张，排列紊乱，有炎症细胞浸润；GSPE 200，400 mg/kg组和维生素C组小鼠较模型组有很大的改善，肝脏细胞形态和排列趋于正常，炎症情况减轻。

图1 各组小鼠肝脏光镜下病理形态学改变（HE×400）

4 讨论

老龄化的衰老涉及机体多个组织和器官，是一种渐进的生理功能障碍过程。D-半乳糖诱导的急性衰老模型，在生理、生化等指标上能有效模拟自然衰老，用量过大可引发机体产生氧化应激、细胞损伤、炎症反应等，加速大脑衰老和认知功能障碍[7]，出现心肌细胞钙超载、凋亡、心脏功能退化[8]，肝脏细胞复制性衰老、肝脏结构破坏、炎性细胞增多[9]、同时免疫系统也被破坏，胸腺、脾脏指数下降[10]。本研究采用D-半乳糖注射建立小鼠衰老模型，观察GSPE对小鼠衰老的干预作用。结果显示，GSPE可改善衰老所导致的脾脏指数、胸腺指数下降，与模型对照组比较，GSPE中、高剂量组脾脏、胸腺、肝脏指数显著改善，组织病理学结果显示，GSPE中、高剂量组肝脏细胞结构清晰，细胞数量增加，说明GSPE对D-半乳糖诱发的肝脏细胞损伤也有抑制效果。

衰老会导致体内自由基防御系统逐渐下降，如SOD、GSH-Px等酶的活力下降[9]。SOD是机体内清除自由基的主要物质，生物体中SOD的水平是象征着衰老和死亡的直观指标[11]；GSH-Px是一种重要的体内过氧化物分解酶，是生物抗氧化能力的指标之一[12]。测定 SOD、GSH-Px酶活力变化可间接反应机体的衰老程度。生物体中，自由基作用于脂质过氧化的最终产物是MDA，MDA的大量产生加重了细胞膜的损伤[13]。本研究显示模型对照组小鼠血清、肝脏及皮肤组织中的SOD、GSH-Px含量显著降低，MDA含量升高，应用中、高剂量GSPE进行治疗后小鼠血清、皮肤、肝脏中的SOD、GSHPx 酶活性显著升高、MDA含量降低，进一步证明GSPE可通过对抗氧化应激反应改善衰老。

HYP是胶原纤维和胶原蛋白中主要的非必需氨基酸，是检测机体胶原代谢的重要指标，也是评价皮肤衰老的重要指标[14]。本研究进一步测定了衰老小鼠皮肤组织中HYP的含量。研究显示，与空白对照组比较，模型对照组皮肤组织中HYP的含量明显升高，用中、高剂量GSPE进行治疗后皮肤组织HYP的含量降低。

总之，研究结果显示GSPE具有抗氧化、预防衰老的作用，可为葡萄籽相关产品的开发利用提供更多的选择。