山楂叶总黄酮提取工艺与药理作用研究进展

张德馨，王淑华，孙 仟，林 林，张 雪，林永强＊

（1. 山东中医药大学，山东 济南 250355；2. 国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022；3. 山东省食品药品检验研究院 国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室，山东 济南 250101）

山楂是药食两用的传统中药材，能消食健胃、活血化淤、收敛止痢，对肉积痰饮、小儿乳食停滞等均有疗效。随着研究深入，发现山楂叶也有很高的药用价值，黄酮类物质如牡荆素，6, 8-二葡萄糖芹菜素，黄酮苷，牡荆素葡萄糖苷，槲皮素，金丝桃苷（HP），山柰酚，木犀草苷，牡荆素鼠李糖苷（VOR）等是其提取物中的主要活性成分[1]，具有调节脂质和糖代谢、护肝、抗氧化、扩张冠状动脉等多种药理活性。

目前，山楂叶总黄酮（HLF）的提取方法不断创新，对其药效机制的研究也有了新的突破。本文对近年HLF的提取工艺与药理活性的研究成果加以归纳，以期为山楂资源的开发与合理利用提供参考。

1 HLF的提取工艺

1.1 浸提法

姜红红等[2]采用70 %乙醇，料液比1:10（g/ml），70 ℃条件下保持微沸提取2.5 h，用LX158型号树脂，3 BV水洗除杂后，用10 %乙醇洗脱除杂，6 BV的30 %乙醇洗脱的方案，依据药典方法进行分离条件优化，解决了现有山楂叶提取物的制备方法成本高、总黄酮含量低的技术问题。

1.2 回流提取法

施红林等[3]发现在液固比29 ml/g，乙醇体积分数68 %，水浴温度64 ℃，提取时间34 min的条件下HLF的平均粗提取率只有3.07 %。宋小峰等[4]采用醇提法，较施红林等[3]延长了提取时间与温度，使总黄酮提取率达到92.2 %，优选出最佳的提取工艺为乙醇体积分数65 %，提取时间80 min，提取温度（67±1）℃。

1.3 超声波辅助提取法

赵永福等[5]采用超声波辅助提取法，在乙醇浓度50 %，料液比1:24（g/ml），pH 7，提取温度 60 ℃，提取时间0.5 h 条件下HLF得率为2.43 %。弓威等[6]比较乙醇回流，超声波辅助提取，普通浸提法等提取工艺的优劣，发现超声波辅助提取法明显优于其他方法。最终采取乙醇体积分数70 %、料液比1:35、超声功率480 W、提取时间39 min、提取温度72 ℃的方案，显著缩短了时间，HLF平均得率为28.991 mg/g。磨正遵等[7]优化超声波辅助提取条件为超声波功率140 W、料液比1:56、提取时间120 min、温度59 ℃。该方法克服了传统有机溶剂易污染黄酮成分的缺点。

1.4 超高压萃取法

奚玉石等[8]首次把超高压技术应用到HLF的提取上，将山楂叶粉碎干燥，与45倍量50 %乙醇在无菌条件下混合塑封，300 MPa压力下处理10 s，提取1次。结果表明超高压技术不仅能在较短时间内获得较高的提取率，且提取液的颜色澄清，杂质少。周志强等[9]提出给压超过400 MPa时提取率变化不大，与奚玉石[8]提出的由于细胞内溶出的大分子物质阻塞传质通道，给压过高不利于黄酮类化合物的扩散的观点一致。

1.5 微波提取

微波场中释放的能量被样品吸收后，产生的热效应扩可破环细胞结构，使成分加速溶出。施昶[10]通过响应面试验优化微波提取HLF的条件，最终确定在体积分数56 %乙醇中浸提15 min，液固比为51 ml/g，微波辐射时间3.70 min的提取条件。

2 药理作用

2.1 对心血管的影响

2.1.1 治疗慢性心衰 贺粤等[11]采用结扎冠状动脉前降支引起的慢性心衰小鼠模型，发现200 mg/(kg·d)的HLF能提高小鼠左心室射血分数，对血管紧张素II（Ang II）、血浆醛固酮的表达有较好的减弱作用，从而抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RRAS）系统，与卡托普利在心衰方面治疗作用相当。Holubarsch等[12]对山楂叶醇提物低聚原花青素类成分WS 1442的现有临床前和临床数据进行分析，发现该中草药产品对心力衰竭的浮肿、呼吸困难、疲劳等症状疗效显著，可改善轻度至中度心力衰竭患者的心功能和运动耐量，并具有正性肌力作用，且不会引起再灌注心律失常、食欲不振、便秘、肝纤维化等特定的不良反应。

徐颖等[13]采用Ang II致心肌细胞肥大的慢性心衰模型，发现配合使用200 μg/ml HLF能干预慢性心衰模型中线粒体的功能，减轻心肌细胞中线粒体的内、外膜损伤率，显著降低心肌细胞直径，并能下调Ang II所致异常升高的蛋白质含量，从而保护心肌细胞。

2.1.2 保护缺血心肌细胞 心肌酶的浓度可以作为检测心肌缺血程度的指标。孙建峰等[14]采用麻醉后结扎犬冠状动脉前左降支方法建立急性心肌梗死模型，发现使用高、中剂量HLF注射液的动物ST段升高总值及梗死范围占全心质量百分比、心室质量百分比明显低于对照组，在血清中检测到的肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）等浓度较低，超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，表明HLF可保护缺血心肌细胞结构的完整性，抑制心肌酶的释放，减少心肌梗死面积。推测其作用机制与减少心肌细胞耗氧量，增加冠脉流量，降低细胞膜的通透性有关。

邱晓梅等[15]研究发现静脉注射HLF对缺血心肌细胞灌注前后的心功能有明显影响，心肌酶浓度、丙二醛（MDA）浓度降低，SOD水平升高，表明HLF能抑制氧自由基（ROS）引起的脂质过氧化反应，这一结果与Koch等[16]总结山楂叶黄酮对心肌再灌注损伤细胞的作用机制结论一致，即山楂叶黄酮可削弱缺血极早期细胞氧化磷酸化水平降低造成的去极化作用，阻滞钙内流，减轻细胞钙超载，增强抗氧化能力，减少室性心律失常的发生率，对缺血的心肌细胞起直接保护作用。

2.2 抗脑缺血作用

李蒙蒙等[17]对大鼠侧颈总动脉永久性双重结扎，建立慢性脑缺血模型。结果显示用HLF灌胃的大鼠神经细胞形态完好，密度增加，脑组织病变减轻。表明HLF可减弱因神经胶质细胞过度活化分泌的抑制因子、受体及炎症递质的表达，减轻炎症反应，增强神经元与轴突的再生能力。还能通过减弱p38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）表达水平，阻止脑细胞凋亡，调节脑细胞生长，对血管性痴呆小鼠的记忆力有良好的改善作用[18]。

曲若宁等[19]观察发现HLF对脑缺血再灌注模型大鼠损伤的海马CA1区有显著改善，并与治疗脑缺血成一定的量效关系，能维持神经元细胞的超微结构，减轻神经细胞损伤，减少脑组织死亡区域，其机制与抑制胱天蛋白酶3（caspase-3）蛋白酶的阳性表达，减轻细胞凋亡效应有关。陈进玲等[20]发现HLF联合丁苯酞能调节老年脑梗死患者总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等血脂水平，能更好地改善大脑动脉血管狭窄，使神经系统损伤评分降低。HLF还能改善缺氧复氧诱导的神经细胞损伤，保护作用可能与增强miR-133b表达，进而降低X-连锁的RNA结合基序蛋白（RBMX）的表达能力有关[21]。

2.3 抗动脉粥样硬化

高英英等[22]认为HLF可稳定动脉组织中基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）的蛋白水平，使纤维帽胶原消融、生长环境达到平衡，维持血管结构。另外，使用HLF注射液后小鼠血管壁中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）mRNA增加，推测HLF含PPARγ配体类物质，能抑制细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的基因表达，阻止单核细胞动脉硬化斑块迁移，减轻大鼠动脉粥样硬化血管的内皮损伤程度[23]。于悦卿等[24]研究表明HLF能降低ApoE基因敲除小鼠的TC、TG、LDL-C含量，增强抗炎因子白介素8（IL-8）水平，降低MDA含量，增加SOD含量，调节动脉硬化导致的内质网应激状态。

2.4 保护肝功能

2.4.1 减轻酒精性肝损伤 HLF被证实能通过减少肝细胞凋亡[25]，并清除自由基，提高抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化反应来减轻酒精性肝损伤[26]。

2.4.2 减轻非酒精性肝损伤 环氧合酶-2（COX-2）是引发炎症反应的重要介质之一，参与肝脏充血、水肿等症状的发生与发展。在HLF干预下，高脂导致的肝损伤小鼠体内血红素氧合酶1（HO-1）的表达增强，COX-2的表达降低，鼠抗8-羟基脱氧鸟苷酸的表达减弱，证明HLF可减轻DNA氧化导致的细胞损伤和肝组织炎症，显著提高肝组织总抗氧化能力[27]。

核因子E2相关因子2（Nrf2）在保持氧化和抗氧化之间的平衡及减少氧化应激引起的损伤中起着关键作用。研究发现HLF通过增加Nrf2、HO-1，谷氨酸半胱氨酸连接酶、NAD（P）H醌氧化还原酶1的表达，在抗氧化中起重要作用[28]。反映出HLF可缓解肝脏氧化应激，维持肝细胞功能，祛除炎症反应，增强肝脏的抗氧化能力。

降低P4502E1 mRNA和蛋白表达是治疗非酒精性肝病的靶点。陈芝芸等[29]发现随着给小鼠灌服的HLF浓度升高，对细胞色素P4502E1的抑制活性增加。一方面能使谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、SOD分解过氧化物的活性增强，减少自由基的生成；另一方面可避免脂质积累产生的活性氧诱导下游促炎症因子的表达。

2.5 降压调脂质作用

张振等[30]研究发现，HLF可降低高脂高盐小鼠血清中CPK、LDH、AST的活性，并提高抗氧化酶如SOD、GSH-Px的活性，保护缺血心肌细胞，还能降低Ang II水平、血脂含量和心脏做功系数，抑制血管的过度收缩，降低血压并维持舒张压和收缩压的稳定。

刁婷婷等[31]以高脂血症大鼠为研究对象，发现经HLF灌胃处理的大鼠肝脏组织中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）表达增加，乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化减弱，脂肪酸的合成速度减缓，脂肪变性与浸润程度减轻，脂质代谢增强，肝脏脂质沉积状况呈剂量依赖性改善。推测其机制与调节AMPK/ACC通路的蛋白表达水平有关。HLF还能激活法尼酯衍生物受体，下调固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）表达，对甘油三酯的积累有一定的消除作用[32]。

另外，HLF还能有效缓解组织培养肝细胞受抑制状态，减轻脂肪变性、炎性细胞浸润、肝细胞肿胀等药理损伤，能降低羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）、上调低密度脂蛋白受体（LDLR）的阳性表达。HLF不但减少胆固醇的合成，还能清除肝脏中游离的胆固醇[33]。

2.6 治疗糖尿病并发症与抗氧化作用

2.6.1 治疗糖尿病并发症 齐淑芳等[34]采用注射链脲佐菌（STZ）配合高脂高糖喂养诱发2型糖尿病大鼠为研究模型，发现HLF能增强骨形成蛋白-7表达，减弱肾组织转化生长因子β1的表达，从而改善糖代谢异常为主因所致的肾小球硬化，使肾脏细胞纤维化概率降低，并明显减轻大鼠肾细胞受损程度及尿蛋白、肌酐、血糖及血尿素氮含量，维持肾脏正常生理功能。赵晓莲等[35]还发现HLF对肾小球系膜细胞增生、胞内脂质堆积，肾小管扩张肿胀等病理性改变同样有治疗作用，有明显降糖效果，对糖尿病肾小球硬化症早期的微血管病变有良好疗效，推测机制与降低肾局部胰岛素样生长因子1（IGF-1）及胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP-3）过表达有关。

HLF除了能维持肾脏生理功能外，另有研究表明HLF对STZ诱发2型糖尿病小鼠的胰腺组织[36]、睾丸[37]、脑组织[38]都有显著的保护作用。不仅能保护各组织的细胞形态并降低其凋亡系数，还能增强组织中抗氧化酶的活性，改善胰腺、睾丸、脑组织中超微结构病变，维持血糖和胰岛素分泌的稳定性。

韩伟[39]发现高、中剂量VOR、HP可下调AMPK、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）mRNA表达水平，并明显降低高糖高脂培养胰岛素抵抗（IR）HePG2细胞内的TC、TG积累，维持细胞的糖脂代谢平衡，其机制可能与激活AMPK通路有关。

2.6.2 抗氧化作用 龚霞等[40]萃取山楂叶有机提取物中不同部位的极性组分，比较其对DPPH自由基、超氧自由基及Fe2+螯合能力的影响。结果表明正丁醇相的总还原能力最强，石油醚相的抗氧化能力远低于其他组分。

李艳荣等[41]发现山楂叶 50 %乙醇提取物、50 %乙醇的乙酸乙酯部位、50 %乙醇的水饱和正丁醇部位、2015年版《中国药典》收录的HLF均具有一定的体外抗氧化能力。且总黄酮含量越高，抗氧化能力越强。

2.7 其他药理作用

实验表明HLF能有效降低恶性胶质瘤 U87 细胞的黏附能力，可引起瘤细胞外形皱缩、破损，对瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力有明显抑制作用，作用强度与浓度呈正相关[42]。Zhang等[43]发现，使用HLF治疗后，脊髓损伤大鼠脊髓组织的病变腔和凋亡细胞数减少，神经元水肿减轻、内尼氏小体增多。即HLF能保护受损的大鼠脊髓神经，在脊髓损伤后促进躯干恢复运动协调性中具有治疗潜力。

3 讨论

在提取工艺方面，黄酮类化合物作为山楂叶的药效指标成分，单纯溶剂提取虽然操作简单、HLF得率高，但耗时长。超声波的热效应与机械振动的助溶作用，会加速细胞内物质的释放，能缩短时间、提高效率。超高压提取法短时间内极高的压力差变化则促进了提取溶剂的渗透及有效成分的溶出，与加热回流法相比，溶剂的挥发减少，升压、保压、卸压、加料等单元借助机械完成，也无较大的能量消耗。微波技术可使用更少的溶剂量，使整个物料内部加热，克服了传统加热方法由外向内，升热较慢的缺点，而微波提取技术与传统溶剂提取法相结合的方法温和安全。市面上流通的HLF注射液的制备多为企业专利，可查阅到的粗提方法有取山楂叶在40 %乙醇、50 ℃下浸提后再加工[44]。而超声波辅助提取、超高压提取与微波提取可同时处理较大的批量，选择性高，能节约时间和经济成本。

目前，HLF在解决高致病率、高死亡率的心血管问题，参与2型糖尿病并发症与肝肾系统损伤的治疗中均有良好表现，其抗氧化、抗炎、降脂、调节酶活性等作用成为研究热点。山楂树叶资源有广阔的开发前景。