补体调节剂治疗骨关节炎研究进展

（山东省医学科学院 药物研究所，山东第一医科大学，山东 济南 250062）

骨关节炎（OA）又称退行性关节病[1]，其主要以关节边缘软骨异常增生、软骨脱落为病理特征[2]，临床表现为慢性关节疼痛、肿胀、活动时伴有摩擦声等，终末期可致患者关节畸形甚至丧失行走能力[3]。对于OA治疗，传统药物大多仅能缓解症状，无法控制疾病进展，效果不明显，还会引发不良反应。外科手术能快速延缓关节损伤，但不能很好地解决关节软骨修复与重建问题,更不能逆转关节软骨进一步被破坏的进程[2,4]。蛋白质组学技术和质谱法研究表明[5]，补体蛋白在OA患者的关节滑液中发生异常表达，主要包括C3，C4，C5补体蛋白的异常增多，从而引起补体激活，C3和C5转化酶形成增加，最终导致膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）生成增多，促进关节损伤和炎症。本文对OA基于补体系统的分子发病机制进行分析，并总结几种针对C3，C4和C5的补体蛋白调节剂，旨在为OA治疗提供更多有效方案。

1 补体系统在OA发生发展中的免疫发病机制

研究表明，OA是先天免疫系统介导的较低程度的炎症[5]。分析OA患者滑液和细胞膜发现，先天性免疫系统的主要细胞和因子，包括补体激活片段和其促炎受体，均以明显升高的水平存在于关节滑膜中，表明补体系统在OA组织损伤中有重要作用[6]。研究发现，OA患者关节滑液中的补体激活后，会产生多种补体成分，其中C3和C5转化酶进一步形成膜攻击复合物，在靶细胞膜上形成膜孔通道，导致细胞裂解，引发关节炎症；同时，补体激活产物过敏毒素与补体激活诱导的趋化因子相互作用也引起骨损伤加重[6]。补体系统是先天免疫系统防御病原体的首要防线之一，是由30余种蛋白质组成的不耐热蛋白水解级联反应攻击性系统[7]，其成分复杂，包括直接参与补体激活的各种补体固有成分、调控补体激活的各种因子和分布于细胞膜上的补体受体等[8]。补体系统一般有宿主防御和通过过敏素和B、T淋巴细胞刺激来指导适应性免疫调节的作用。因此在OA的分子机制中，还有另一条促使炎症形成的路径，即当宿主细胞受到某种刺激时，攻击系统启动，补体被激活，其中激活产生的C3和C5转化酶可诱导产生C3a和C5a过敏素，两种过敏素可诱导白细胞等免疫细胞产生炎症因子，通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，最终形成OA[9]。综上所述，滑膜关节中补体系统的失调在OA的发病机制中起至关重要的作用。或可通过减少补体激活产物生成，防止细胞裂解，减轻关节炎症。

2 基于补体系统的几种补体调节剂

补体系统激活引起的软骨细胞裂解是目前较为认可的OA发病机制，可由经典途径、替代途径和凝集素途径任意一条途径完成，再经一系列丝氨酸蛋白酶的级联反应，形成MAC、趋化因子和促炎因子等介质[10]。基于补体系统的调节剂能将抑制补体系统激活作为治疗OA的首要目标。同时，补体成分的多样性和补体效应蛋白又为OA的干预治疗提供了多个潜在靶点。根据导致细胞裂解的MAC的主要组分，将补体蛋白调节剂分为C3补体蛋白调节剂、C4补体蛋白调节剂、C5补体蛋白调节剂和新型融合蛋白补体调节剂。

2.1 C3补体蛋白调节剂在OA治疗中的作用

C3补体蛋白是补体系统中的主要成分，也是补体激活途径中的重要中间体。补体激活的3种途径均汇集于激活C3补体蛋白，生成C3转化酶，与多种补体因子和非补体因子相互作用，引发各种生物学效应。在OA的发生发展过程中，C3蛋白一方面形成C3转化酶，进一步诱导MAC形成；另一方面诱导生成C3a过敏素，引起免疫细胞分泌趋化因子，同时C3b还与CR3补体受体连接引发吞噬作用，共同促进OA发生[11]。因此，抑制C3a和C3转化酶形成，可有效治疗骨关节炎症。羧肽酶B（carboxypeptidase，CPB），是一种由Cpb2基因编码，肝脏循环产生，凝血酶-血栓调节蛋白复合物激活的纤维蛋白溶解抑制剂。有文献报道[12]，CPB已被证明可裂解和灭活几种炎症蛋白，如C5a、C3a、缓激肽和凝血酶裂解的骨桥蛋白等。Christin等[13]研究表明，OA滑液中CPB的水平可能升高，并在缓解局部C5a介导的炎症中起关键作用，且体外实验表明CPB很可能通过几种不同的方式抑制MAC形成，从而保护关节免受炎症破坏。靶向CPB治疗是否在OA临床试验中有保护作用尚待确定。另外，衰变加速因子CD55（decay accelerating factor，DAF，CD55）和膜辅因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP，CD46）均有控制C3转化酶的功能。

有文献报道[14]，sushi域结合蛋白4（sushi domain-containing protein 4，SUSD4）也能通过抑制经典途径中C3转化酶形成，抑制补体激活。由于基因剪接选择性的存在，含SUSD4结构域的蛋白一般为膜结合蛋白或可溶性蛋白，如可溶性因子H或膜结合的CD46，通常与活化的组分C3b和C4b结合，并诱导丝氨酸蛋白酶因子Ⅰ降解，从而阻碍C3转化酶形成[15]。但SUSD4只在食道、脑和心脏等组织中有较高的表达，还没有相关文献表明其可在软骨组织表达[16]。Nikolina等[17]研究表明，胶原蛋白Ⅸ的N末端非胶原结构域4（N-terminal noncollagenous domain 4，NC4）可作为补体系统的新型抑制剂发挥作用，能与C4、C3和C9补体成分结合，并直接抑制C9聚合从而抑制MAC组装，促进补体成分C4b和C3b的酶促裂解，加速对C3的裂解，抑制补体激活。血浆H因子（factor H，fH）是替代途径的主要调节因子，促进因子I介导的C3b蛋白水解为iC3b 1，加速C3转化酶的衰变[18]。fH的补体调节功能大多归功于其与FHR家族（FHR-1，FHR-2，FHR-3，FHR-4，FHR-5）的相互作用，其中FHR-1起主要作用，通过阻止C5经由C5转化酶裂解，从而抑制C5a释放，减少C5b-9形成，达到调节补体末端途径激活，减少细胞裂解的目的[19-20]。

2.2 C5补体蛋白调节剂在OA治疗中的作用

C5是补体系统中的重要组分，直接参与补体活化过程，其活化产物C5a过敏毒素可诱导免疫细胞分泌炎症因子，通过C5a受体C5aR1介导促炎作用，从而促进宿主防御，且能调节组织体内平衡。过敏毒素C5a是先天免疫的有效介体[21]，在外源性和内源性病原体及损伤相关分子模式激活补体系统后，通过其受体C5aR1促进炎症。在成骨细胞中，C5a诱导了炎症细胞因子白介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8的迁移和表达，对骨质形成和活性至关重要[22]。敲除了C5aR1基因的小鼠关节中破骨细胞数量减少，骨量显著增加，表明C5a/C5aR1信号可能调节骨骼的生理转换[23]。病理条件下，缺乏C5aR1的小鼠可抵抗关节炎侵害，且C5aR1的活性与骨骼中大量骨丢失有关，C5aR1拮抗剂可显著减少该模型中的牙周炎症和随后的骨质流失[24]。随后发现，成骨细胞是C5a的靶细胞[25]，因为成骨细胞特异性C5aR1过表达的小鼠显示出骨折愈合受损[26]。Yvonne等[27]分析了C5aR1激活后的基因表达模式和细胞内信号转导途径，发现还涉及MAPK和胰岛素途径基因的强调控。此外，还证明了C5aR1和Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）在成骨细胞中相互作用，导致免疫细胞趋化因子上调，这可诱导破骨细胞重新吸收[28]。这些结果表明，补体激活的成骨细胞能与破骨细胞和免疫细胞协同调节炎症性骨疾病期间的炎症环境。

Wang等[15]研究证明了单克隆抗体（anti-C5 monoclonal antibody，mAb）能抑制C5处的末端补体激活，使C5a与C5aR1结合减少，减弱促炎作用，减少骨损伤，表明抗C5的单克隆抗体能有效防止并延缓胶原诱导型关节炎发生。CD59是一种有效阻止MAC形成的膜蛋白，该膜蛋白可通过抑制其他C9分子插入C5b-9复合物的方式，抑制大型MAC形成，维持软骨细胞的完整性[29]。Bloom等[30]研究雄性小鼠CD59a基因缺失对维持骨骼结构的影响，结果表明CD59a基因缺失可导致骨骼体积变大，密度变小，使小鼠更易患OA。另外，内源性补体调节蛋白还包括衰变加速因子CD55，主要通过抑制体内C3、C5转化酶形成阻止补体活化。目前，针对C5补体蛋白调节剂药效动力学研究，提出了新型特异性抗体重组抗C5微型抗体MB12/22[31]，其能特异性识别人补体C5，参与补体激活抑制过程，关节内注射的MB12/22能减少关节滑膜的损伤，缓解关节肿胀，降低肿瘤坏死因子水平，改善组织形态学变化。

2.3 C4补体蛋白调节剂在治疗OA中的作用

C4补体蛋白是滑液中同源型补体因子C4a和C4b的混合物[32]，也是经典途径和凝集素途径中的共同成分，能裂解补体激活经典途径中的C3补体。C4b结合蛋白（C4-binding protein，C4BP）是经典和凝集素途径的主要可溶性内源抑制剂，是一种血浆寡聚糖蛋白，其主要功能包括调节补体激活和止血。有文献报道[33]，C4BP不仅与凝血有关，在成纤维细胞的结缔组织重塑过程中也可能起作用。纤维蛋白在滑膜组织内沉积是滑膜炎的一个突出特征，纤维蛋白-成纤维细胞相互作用可能是滑膜细胞活化导致获得OA侵袭性表型的决定因素。每个C4BP链均有一个C4b2结合位点，C4BP主要通过与膜结合性维生素K依赖性蛋白S相互作用[34-35]，从而减少C3转化酶形成，抑制补体激活的经典途径。通过这种机制，可防止潜在有害的补体过度活化。

对于OA，调控补体系统失调的控制因子还有很多，怎样将自身免疫系统的补体抑制剂作用放大并用于临床将是目前防治的关键。为了防止补体介导的组织损伤，系统的活化和抑制之间需要通过几种可溶性膜结合的抑制剂建立良好的平衡。大多数抑制剂通过以下两种途径起作用：加速补体转化酶的衰变，或通过丝氨酸蛋白酶Ⅰ因子促进活化的补体因子C3b和C4b的酶促裂解。1型补体受体（complement receptor1，CR1）或称CD35是红细胞、白细胞等膜上的糖蛋白，有加速补体因子衰变的活性，并作为辅酶促进C3b、C4b对C3的裂解作用，是一种有效的补体激活抑制剂[36]。能辅助C3b、C4b裂解作用的因子还有很多，如fH为一种主要的补体可溶性抑制剂，通常与活化的组分C3b和C4b结合，并诱导丝氨酸蛋白酶Ⅰ因子降解[37]，还可阻止替代途径中补体C3转化酶组装并加速其降解[38]。另外，Sjöberg等[39]进一步验证了fH与纤维调节蛋白（fibromodulin，FMOD）和骨黏附素（osteoadherin，OSAD）结合，能增强彼此的补体抑制活性。该研究在阐明补体和细胞外基质成分之间相互作用方面取得了一些进展，可指导开发对抗异常补体激活的新型疗法。

2.4 融合蛋白作为补体调节剂在治疗OA中的作用

新型融合蛋白能特异性靶向作用于某种补体蛋白，将大大提高其对补体系统的抑制效果。为进一步评估补体系统在OA动物模型中的作用，Banda等[40]研究了含有补体受体2（complement receptor 2，CR2）和fH的重组替代途径抑制剂CR2-fH（complement receptor 2 and factor H，CR2-fH）对胶原诱导型OA模型小鼠的治疗作用[41]。该试剂包含编码来自CR2的iC3b/C3d结合位点的氨基末端结构域和替代途径诱导的OA小鼠fH的5个短重复序列的氨基末端[42]。在对含Ⅱ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原单克隆抗体的免疫复合物进行的体外研究中，小鼠滑膜和软骨中的C3沉积显著降低，C3a生成减少，MAC生成显著减少，关节损伤减轻。表明CR2-fH有体外特异性靶向C3补体作用，并特异性抑制补体激活的替代途径，对经典途径的影响最小，对凝集途径几乎无影响[42]。Michelfelder等[43]研究了一种新颖的组合方法，合成新的融合蛋白MFHR1。该蛋白将fH的调节域与FHR-1的C5转化酶/C5b-9抑制片段连接起来。在功能上，该蛋白将fH的C3调控域和其能靶向细胞表面的结构域，与衍生自FHR-1的C5b-9形成抑制末端途径调控域结合起来，通过同时靶向C3和末端途径来调节补体激活。OA体外试验中，MFHR1在抑制C5转化酶激活和C5b-9组装方面表现出辅助因子和衰变加速功能，阻止C3b沉积并减少C3a、C5a和C5b-9的生成[44]。结果表明，MFHR1能在多个级联水平上同时靶向补体激活，可提供优化的补体抑制作用，主要抑制经典途径和替代途径的活性。因此，MFHR1可能为补体相关疾病的治疗提供新的基础。与单独靶向C3或C5的方法相比，调节剂在补体级联中同时影响多个效应位点[45]，包括抑制C3抑制、C5裂解抑制和C5b-9形成。特别是由于MFHR1还可阻止C3a和C5a形成及C3裂解产物积聚，有望对其他补体相关疾病中的局部炎症和疾病进展产生积极影响。除了MFHR1调节补体过度活化的治疗潜力外，这种多靶点策略可指导开发更多新的补体疗法。

3 总结与展望

随着人们对OA病理机制的深入了解，补体系统成分的多样性和复杂性为补体多靶点治疗提供依据，为尽快寻找有效的OA治疗药物，新型融合蛋白补体抑制剂的开发可作为未来治疗OA的研究重点。相信随着各种新方法和生物学新技术的开发应用，OA的治疗效果会越来越好。