衰老对小鼠角膜厚度和眼表的影响

章爽 高桂平 黎彪 李秋玉 葛倩敏 梁荣斌 石文卿 邵毅

(南昌大学第一附属医院眼科，江西 南昌 330006)

随着年的增加引发的与年龄有关的慢性疾病不断增加，其中，老年干眼症患病率呈逐年增长趋势〔1〕，目前国内针对老年人干眼的发病危险因素的研究文献较少，衰老如何参与老年干眼发病过程的机制及是否会导致角膜结构及角膜厚度变化仍不清楚，本文通过眼前段光学相干断层扫描血管成像(OCTA)检测衰老对啮齿动物小鼠所引起角膜厚度变化及通过相关技术检测衰老对小鼠基础泪液分泌试验(SIT)、泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色(FL)评分的影响，进而进行相关性分析以评估临床和体外测量之间的潜在关联。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取12只由南昌大学医学院动物中心提供的健康的、体重为18～21 g、鼠龄为6周龄的雌性C57小鼠(均为 SPF 级实验动物)，使用裂隙灯显微镜及眼底镜检查眼前节、眼底无异常，饲养至2月龄和24月龄时分别进行实验。在研究过程中，保持在标准化的环境中饲养:恒温为(23±1)℃，相对湿度60%±5%，12 h明暗周期中(早上8∶00到晚上8∶00)，小鼠均给予相同的水量和食物，对实验动物的使用和喂养均符合动物伦理学并遵循 《 实 验 动 物 管 理 条 例 》，在实验过程中尽可能减少实验动物的应激，处置动物时尽量减少实验动物的痛苦和伤害〔2〕，由于月龄为24月龄的C57小鼠的年龄相当于一个大约65岁的人类，这可能会提供关于衰老如何影响人类眼表的关键见解〔3〕，取24月龄小鼠为研究对象，以小鼠年龄变化作为自身对照，实验分为A、B两组，均取小鼠右眼作为实验眼，A组为饲养至2月龄C57小鼠(12只)，B组饲养至24月龄C57小鼠(12只)。

1.2实验方法

1.2.1BUT检测 根据文献〔4〕下方结膜囊内滴入1滴 1% 荧光素钠溶液，使其瞬目，在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察，正常的角膜上皮不染色，染为绿色代表角膜上皮缺损，记录角膜染色区出现第1个破裂点的时间。

1.2.2SIT检测 根据文献〔5〕下方结膜囊内滴一滴盐酸丙美卡因(爱尔凯因)滴眼液表面麻醉后,在小鼠右眼外眦中外1/3交点的地方放置酚红棉线(天津京明新技术发展有限公司，中国天津)的一端，线的边缘轻轻钩住下眼睑，并计时60 s,指示卡颜色由黄色变红色时立即测量，用游标卡尺测量酚红棉线红色部分的润湿长度(以mm为单位)，计算泪液分泌量。

1.2.3FL测定及评分 根据文献〔6〕方结膜囊内滴入1滴1%荧光素钠溶液,使其瞬目，观察裂隙灯钴蓝色光下角膜上皮着染，参考国家眼科研究临床干眼评分系统〔7〕，分为 0 ～4分：0分：没有染色；1分：轻微点状着染，少于30点；2分：点状染色超过30点，但没有成片；3分：严重弥漫性染色，但没有斑块；4分：有荧光素斑块。

1.2.4角膜上皮及全层厚度 所有小鼠角膜厚度的测量采用 AngioVue OCTA 系统，模式调为视网膜成像模式(AngioRetina 模式)，采用分频辐去相关血管造影算法(SSADA) 进行成像〔8〕，横向分辨率设置为 15 μm，轴向分辨率设置为 5 μm，并使用前段透镜光学适配器镜片，采用 840 nm 波长、宽度22 μm 的光源获取 3D 扫描图像〔9〕，对所选小鼠进行检测时，由于OCTA 系统默认的聚集是针对视网膜，所以在测量角膜全层及角膜上皮厚度时要关闭自动聚焦功能〔10,11〕，确定扫描中心，双眼定期给予生理盐水滴眼液，以维持角膜水合。以上实验，进行每次检查时应注意控制变量，实验应由同一技师在相同的时间、地点，相同的照明亮度、湿度及温度下操作。

1.2.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、t检验、Mann-WhitneyU检验。

2 结 果

2.1两组SIT、BUT和FL评分比较 B组BUT 明显短于A组，SIT明显长于A组，FL评分明显高于A组(P<0.05)。见表1、图1。

表1 两组SIT、BUT 和 FL 评分比较

2.2两组角膜上皮厚度和角膜全层厚度比较 角膜较清亮，晶状体尚清，B组角膜稍水肿，可见晶状体混浊。见图1。B组平均上皮厚度小于A组，而平均角膜全层厚度大于A组，差异具有统计学意义(P<0.05)。 见图2、表2。

图1 两组角膜眼前节及角膜荧光染色(×16)

图2 两组小鼠角膜上皮及全层厚度测量(×16)

表2 两组角膜厚度比较

2.3两组角膜极值比较 两组角膜厚度及角膜上皮厚度均有显著差异(P<0.05)，但两组角膜厚度及角膜上皮(MIN-MAX) 差值比较无统计学意义(P>0.05) 。见表3。

表3 两组角膜上皮和角膜厚度极值比较

3 讨 论

干眼症为任何原因所致泪液质或量，或动力学的异常，从而导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织损害为特征的多种疾病的总称。干眼患者轻者常表现为眼部干涩感，异物感、烧灼感及视疲劳等，重者可导致角膜上皮损害并形成角膜新生血管〔12〕，干眼是一种复杂的影响眼表和泪腺的多因子疾病，主要由细胞凋亡、炎症及性激素水平失调等机制所致〔13〕，清楚了解病因将有助于本病的防治。

正常的眼表和泪腺组织均有丰富的神经支配，通过完整的神经反射环路完成泪液分泌功能，由于环境变化引起的角膜传入神经元的激活可增加了基底泪液的分泌，但与此矛盾的是，有研究表明，泪液分泌增加与中央和外周角膜的基底下神经丛(SBNP)和表面神经末梢(SNTS)的神经总和长度减少相关，多模态角膜神经的亚突起主要表达瞬时受体电位(TRP)M8或TRP阳离子通道Ⅴ亚家族成员(TRPV)1伤害性感受器〔14〕，TRPM8角膜神经主要参与泪液调节及负责角膜表面冷却，通过对啮齿动物相关研究，老化可能使这些冷感受器发生结构和功能上的改变，并且随着年龄的增加，数量会减少〔15〕，因此，老年小鼠较高的泪液分泌可能与TRPM8特异性神经信号的减少有关，此外，随着年龄的增大，鼻泪管结构的改变会导致较低的泪液排泄率〔16〕，推测老年小鼠较高的泪液分泌可能与TRPM8特异性神经信号的减少及鼻泪腺系统的变化有关，这使得衰老小鼠的泪液分泌较多。

虽然老年小鼠有较高的泪液分泌量，但在我们实验中观测到，老年小鼠的BUT缩短，这是由于泪膜层由脂质层，水液层，黏蛋白层三层组成，泪膜厚度较薄，仅约3 μm〔17〕，因此更容易发生损伤，随着年龄的增加，泪腺和睑板腺可能会发生导管周围纤维化，腺泡细胞萎缩和淋巴细胞浸润等变化，此外，泪腺及睑板腺的分泌还受到激素的影响，雄激素可以增加泪腺分泌，同时还可以促进和调节睑板腺的分泌〔18〕，在一些雌性患者中，随着年龄的增加，体内的激素水平越来越低，这使得睑板腺、泪腺的分泌功能也逐渐降低，而睑板腺的功能降低会使脂肪层完整性的降低〔10，19〕，脂肪层在调节眼表泪膜蒸发中起着关键作用，虽然老年小鼠的水液层增多，但脂质层是减少会造成泪膜的稳定性降低，泪膜容易破裂，这使得衰老小鼠泪膜更容易破裂。

角膜是机体神经末梢分布密度最高的器官之一，丰富的感觉神经来源于三叉神经的眼支，感觉神经纤维从睫状神经长神经发出分支，穿过前弹力层在上皮下形成上皮下神经丛，从基底下神经丛开始，垂直方向的轴突向前突出，终止于浅上皮，这使得角膜敏感度较高，有研究表明，小鼠浅上皮和基底区角膜神经总和长度和垂直神经投射密度会随着年龄的增长显著降低，而与此移植的是小鼠的机械角膜敏感度随着年龄的增长而降低，这与基底下神经轴突的密度降低是相平行〔19〕，角膜神经可以检测外界伤害，有害物质及温度，从而做出相应的反射，减少伤害，随着年龄的增加，角膜神经支配减少，这使得角膜保护机制降低，从而容易受到角膜损伤，本实验发现老年小鼠的上皮厚度降低，FL增加可能与年龄引起的角膜神经减少所造成的角膜防御机制降低有关。

使用OCTA来评估角膜结构过程中，发现老年小鼠上皮厚度变薄，而角膜全层厚度增厚，由于老年小鼠泪膜稳定性降低，同时加上各种炎症因子的影响，使得角膜基质活性代偿性增强，胶原纤维开始合成，使得角膜基质层增厚，此外，角膜内皮层的Na+-K+-ATP 酶泵维持基质层的半脱水状态，使角膜保持透明状态，随着年龄的增加，角膜内皮数量随着年龄增加而减少，细胞代偿性增加，Na+-K+-ATP 酶泵功能相对降低，导致角膜基质层水肿增厚，而基质细胞所组成的基质层占角膜厚度的 90%，因此这使得角膜上皮全层厚度也相应地增厚〔20〕，因此推测这可能是衰老引起角膜全层厚度增加的原因。

综上，应当加强对老年干眼患者的重视，了解发病高危因素，及时采取相应的防治措施，及时治疗，从而提高老年人的生活质量。