微流控芯片技术在微生物检测中的应用

王楷宬，孙瑞妮，姜 楠，姜利建，庄青叶，李 阳，王素春，张富友，5，赵成龙，潘子豪，孙福亮，刘华雷

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114；3.南京农业大学，江苏南京 210095；4.延边大学，吉林延吉 133000；5.山东农业大学，山东泰安 271018）

微流控芯片（microfluidic chip）是当前微全分析系统（miniaturized total analysis systems）发展的热点。微流控芯片分析以芯片为操作平台，以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象。微流控分析芯片最初在美国被称为“芯片实验室”（lab-on-a-chip），在欧洲被称为“微整合分析芯片”（micrototal analytical systems），材料科学、微纳米加工技术和微电子学的发展使得微流控芯片也迅速发展[1]。

微流控芯片是以微通道网络为结构特征，在纳米甚至纳米级通道中实现分析设备的微型化，具有液体流动可控、消耗样品和试剂极少、分析速度快等特点，它可以在短时间内完成样品的高通量分析，并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程[2]。该项技术已被应用于细菌检测、病毒检测、基因分型、耐药性检测等微生物检测与分析研究，但在动物疫病检测中的应用很少，国内外鲜有相关报道。本文对微流控芯片的原理、结构及其在微生物检测中的应用进行综述。

1 原理

微流控芯片是把生物和化学等领域中所涉及的采样、预处理、分离富集、混合、反应、检测或细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成到芯片上，由微通道形成网络，以可控的流体贯穿整个系统，用以完成常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术[1]。微流控芯片可将核酸、蛋白质等分子的反应、分离、制备和检测等集中在一个芯片上，完成一系列步骤，如生物样品制备、生物化学反应、液相色谱分析、PCR 反应、电泳检测等。这些操作往往在流体中发生，在常规试验中样品常常以毫升度量，而在微流控芯片上则需要实现所需流体从毫升、微升降级至纳升、皮升。流体在微尺度下具有层流、高效的物理化学交换等优点，利用这些特点，人们在微米尺度上可实现对流体理化性质的控制[3]。微流控芯片在上述理论基础上，结合分子生物学和免疫学技术，可以实现多样本、高通量的微生物检测，实现“样品进-结果出”的自动分析。

利用微流控芯片进行微生物分子生物学检测的流程（图1）为：首先对样品进行处理，包括从临床样品中分离病原DNA 和RNA，然后在芯片上扩增提取核酸，并将扩增子杂交到探针上（步骤以蓝色表示）。扩增和杂交过程都是在芯片上进行的。病原体鉴定（步骤用红色表示）的步骤包括清洗和干燥芯片，随后在光学读取器中读取微阵列并用微阵列图像软件进行分析。此微流控芯片由硅片制造，由微机电系统（micro-electro-mechanical system，MEMS）和提供机械、热和电连接的印刷电路板支架构成。它包含两个连接到微阵列室的硅微反应器。病原体检测可被分为两个芯片版本，分别进行两种不同的多重反应：具有针对DNA 病原体的微阵列布局的DNA 芯片和专门用于RNA 病原体检测的RNA 芯片[4]。

2 结构和制备

微流控芯片包括：白金电阻芯片、压力传感芯片、电化学传感芯片、微/纳米反应器芯片、微流体燃料电池芯片、微/纳米流体过滤芯片等[3]。最早用于微流控芯片的材料是硅和玻璃，但价格昂贵、加工难度大，已被各种低成本材料所取代，如弹性体材料[5]、热塑性聚合物[4]、热固性材料聚合物[6]、纸质材料[7]、生物材料[8]等。

图1 病原体检测工作流程示意图[4]

微流控芯片的结构和制备方式各异，一般应具有加样孔、反应池和主通道。如一种基于免疫学原理能够同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2 型的微流控芯片（图2），由三层组成，包括流体输送层（第1 层）、反应层（第2 层）和废物清除层（第3 层）。在第1 层，有4个入口用于注射次级抗体共轭物、基质溶液、洗涤缓冲液和空气，以及1 个出口与第3 层排水沟相连。第2 层可分为4 个单元，分别测试4 个不同的样本。每个单元有1 个与4 个反应池相连的加样孔，分别用于3 种病毒的检测和对照。4 个单元中的16 个反应池是通过第3 层的1 个中心点连接在一起，既互联互通又可以被平台上的塞子堵住[9]。

检测流感嗜血杆菌的微流控芯片为鱼骨状（图3），芯片内通道长120 mm、宽30 μm，鱼骨每段长60 μm、宽30 μm、高10 μm。制作掩膜后，取干净硅片进行等离子清洗，旋涂SU8-3025 光刻胶制作通道模板，同样操作使用SU8-3010 光刻胶制作鱼骨模板，再使用三甲基氯硅烷进行硅烷化处理，5 min 后倒入1:10 PDMS 184 后水平静置30 min 后置于80 ℃电热干燥箱烘烤30 min。将制作好的PDMS模板在120 ℃下压印在环烯烃聚合物（cycloolefin polymer，COP）上，最后采用雕刻好的光学透明胶（optically clear adhesive，OCA）将上下两层COP 进行不可逆的键合，放入80 ℃电热干燥箱烘烤10 min，芯片制作完成[10]。

美国生物物理学家和生物工程师Lee 等研制的一种称作SIMPLE 的芯片，可在30 min 内同时检测血液中艾滋病病毒和金黄色葡萄球菌。该微流控芯片的结构如图4 所示，它由聚合物PDMS 制备，血液分析部分由一系列井、通道和微井组成。PDMS 具有纳米孔结构，空气可以通过，血液及其他液体不能通过[11]。

3 在微生物检测中的应用

微流控芯片具有体积轻巧、使用样品和试剂量少、反应速度快、大量平行处理及可抛弃式等优点，因此在生物技术研究上的应用范围非常广泛，也被用于细菌检测、病毒检测、基因分型等微生物的检测与分析。

图2 检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2 型的微流控芯片结构[10]

图3 检测流感嗜血杆菌的微流控芯片[10]

图4 SIMPLE 芯片示意图[11]

3.1 细菌检测

该方法在食源性致病菌检测上应用广泛。研究表明，用微流控芯片技术检测食源性致病菌敏感度高。陈炯等[12]利用微流控芯片技术检测食源性致病菌，可同时检测霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌4 种食品中常见的致病微生物。检测结果显示，此方法对霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的检测特异性分别达到100%、100%，96.7%、100%，表明该方法对于4 种菌的检测特异性良好。Yamada 等[7]研制了一种蛋白芯片，用于沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌和李斯特菌5 种食品中常见病原菌的筛选和特异性鉴定。该芯片对5 种常见致病菌有较好的鉴别能力。然而，Rachwal 等[13]将10 种针对5 种细菌（炭疽杆菌、锤状伯克霍尔德菌、假性伯克霍尔德菌、土拉弗朗西斯菌和鼠疫耶尔森氏菌）的PCR 检测方法整合到微流控芯片上，发现微流控芯片的PCR 检测灵敏度相较PCR 降低了10 倍。

微流控芯片技术在临床细菌检测上发挥了作用，其敏感度高、特异性强，除了相对省时外，每个样品的成本也低于常规方法，包括对处理微流控芯片的特定设备和储存微流控芯片试剂的冰箱/冷冻室的要求都相对更低。Fu 等[9]研究了应用微流控芯片检测军人在运动期间发生急性腹泻的病因，发现检测结果与病原特异性荧光实时PCR 检测结果一致。李一伟[14]提出了一种便携式的基于琼脂糖微流控芯片的快速细菌检测方法，将几百微升至几毫升的样品富集至皮升，其捕获效率为90%。从细菌密度上计算富集倍数，其最大的富集倍数为1 000 万倍。尿液样品和血浆样品同样可以在琼脂糖微流控芯片富集。最后结合荧光免疫染色，成功检测到病人血浆样品中感染的金黄色葡萄球菌。

微流控芯片在细菌耐药性检验中也发挥了巨大作用。李一伟[14]建立了一种自定义浓度梯度芯片，用于高通量的单细胞多药耐药性分析。该芯片所形成的浓度梯度由分配通道长短比例决定，保证浓度梯度形成的稳定性并简化芯片设计，使其易于集成化。该芯片可以在单细胞乃至单细胞器水平分析数百个细胞的多药耐药性，可以实时监控单细胞的耐药情况。王欢[15]将环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification，LAMP）和纸质微流控芯片相结合，成功构建了一个快速、灵敏、简便的检测耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPA）的OprL和OprD2基因的方法。早期识别OprL和OprD2基因将有助于更好地选择IRPA 感染的抗生素治疗方案。

3.2 病毒检测

微流控芯片技术在病毒检测中应用广泛。张卫英等[16]研究了微流控芯片检测乙型肝炎病毒（HBV）的基因型，比较了利用上海浩源生物科技有限公司的HBV 基因分型微流芯片和基因测序技术进行的基因型检测结果，发现两种检测方法结果一致，表明微流控芯片具有较高的特异性和灵敏度。

Tan 等[4]利用微流控芯片进行了热带病原体检测，发现该方法对基孔肯雅病毒的RT-PCR 检测符合率为90.0%，特异性为100%，表明基于扩增微阵列的方法灵敏度高、特异性强，在热带病原体高通量检测和鉴定领域具有实用性。与传统的实验室诊断方法相比，用于检测全球重要热带疾病的小型化和简便化的微流控芯片分析方法在检测效率和病原体覆盖度等方面表现出了优势。

针对2019 年发生的新型冠状病毒肺炎疫情，Funari 等[17]基于局域表面等离激元共振原理，开发了一个微流控传感平台，用于人血浆中新型冠状病毒的纤突蛋白抗体检测。陈峰等[18]建立了一个微流控芯片体系用来同时检测9 种呼吸道疾病病毒，试验后对样本进行回顾性检测发现，与用微流控芯片检测结果一致，且在25 min 即可得到检测结果。Wang 等[19]报道了一种基于磁珠和微泵/微阀技术的微流控芯片，集成了细胞裂解、DNA提取、PCR 扩增与光学检测单元，可以快速、自动完成对人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）1B 亚型的4 条不同DNA 片段的同时检测，整个分析时间只需要95 min。Lien[20]等采用芯片RT-PCR 技术检测登革病毒和肠病毒。首先把抗体修饰的免疫磁珠固定在芯片内，捕获目标病毒，然后裂解病毒并抽提病毒RNA，在RT-PCR反应池内进行扩增，实现了自动完成病毒分类富集、RNA 提取和核酸扩增的过程。无论是抗体检测，还是核酸检测，采用微流控芯片检测病毒的准确性均高，操作方便，可全自动完成样品处理和检测过程，且微流控芯片通道的表面积大，能够加快反应速度，在短时间内即可得到检测结果。该方法可移动性高，不局限于实验室内操作，对储存条件要求不高，可用于临床快速实时检测。

3.3 基因分型

李深伟等[21]建立了检测登革病毒的微流控芯片。混合样本的检测结果提示，建立的基因芯片可以清晰分辨出同一份样本中的4 个登革病毒亚型；对28 份样本的检测结果与商品化荧光RT-PCR 试剂盒符合率达到100%。微流控芯片在基因分型上的应用还不常见，但此结果表明此方法准确率高，可清晰分辨4 个亚型，有很强的应用价值。今后可考虑加大研究和推广。

4 动物疫病检测中的应用

微流控芯片在动物疫病检测中应用报道较少。张瑞巧[22]建立了基于磁场集成微流控芯片的禽流感病毒荧光检测方法，在微流控芯片上设计了不同的支路，每个支路固定修饰不同捕获探针DNA 序列的磁球，结合量子点荧光成像技术，实现了不同亚型禽流感病毒（H9N2、H1N1、H3N2）的核酸同步检测，可实现主要流行亚型禽流感病毒的核酸快速现场检测与分型。Wang 等[23]基于微流控芯片技术建立了H7 和H9 亚型甲型流感病毒血凝素的同时自动检测装置，H7N9 和H9N2 的HA 基因检测下限能分别达到3.4 ng/mL 和4.5 ng/mL，并且检测的特异性和可重复性好，能够满足禽流感病毒现场快速检测的需要。

北京莱博泰克生物技术有限公司开发并生产了商品化的基于LAMP 的犊牛腹泻检测芯片。该芯片上有22 个反应室，分为2 个反应区，每个反应区包含2 种引起犊牛腹泻的主要病毒、3 种引起犊牛腹泻的主要细菌、2 种引起犊牛腹泻的主要寄生虫以及阴阳性对照各1 个。该芯片可同时检测2头份样品[24]。还有检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，以及能够同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2 型的微流控芯片等[9，25]。

5 小结

微流控芯片具有小型化、节约试剂、速度快、集成化程度高等优点。微流控芯片不仅能将同一试验的多个步骤集成到一步完成，还能将多种试验集成在一个试验中完成[26]，在微生物检测中凸显优势[15-18]。从试验条件来看，微流控芯片方法无须PCR 实验室分区，具备实验场所可移动的优点，可作为突发公共卫生应急事件的现场实验室，大大提高突发公共卫生应急事件检测效率和准确性，在处理突发公共卫生事件时发挥应急作用。微流控芯片结构微型化且复杂，功能不断增加，使用范围越来越广，在探索微生物学特性方面有较高的应用价值。微流控芯片检测准确度高、用时少、操作方便、结果直观、易于长期保存，且能在短时间内检测海量种类的病原微生物，同样适于动物疫病的高通量病原筛查和监测。