皮肤自体荧光检测技术在疾病诊断中的应用

郭林秀美，章一新

上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海200011

皮肤是人体最大的器官，由表皮、真皮（包括乳头状真皮和网状真皮）及皮下脂肪组成，还包含丰富的血管、淋巴管、神经、肌肉及各种皮肤附属器，承担着防御、感觉、吸收、分泌排泄和体温调节等重要作用［1-2］。皮肤内的部分分子（包括细胞内及细胞外）可以吸收特定波长的入射光（也称为激发光）进入激发态，并迅速发射波长更长的光重新回到基态，产生的发射光即为皮肤自体荧光（skin autofluorescence，SAF）；这些分子被称为内源性荧光团。目前已知的皮肤内源性荧光团有卟啉（porphyrin）、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）、黄素、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）、苯丙氨酸、色氨酸、胶原蛋白、弹性蛋白、脂褐素和角蛋白等［3］。荧光团具有2种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。激发光谱为固定发射光波长后，荧光强度随激发光波长变化的光谱；而发射光谱为特定波长激发光下，产生的发射光的荧光强度在不同波长处的分布情况。这些光谱中荧光强度达到峰值处的波长构成了荧光团的激发/发射对（λexcitation/λemission，λEX/λEM）［4］。由于每种荧光团的λEX/λEM是特定的，因此自体荧光显像及自体荧光光谱具有作为皮肤组织病理及生理状态的分子标记的功能。

目前，包含自体荧光显像及自体荧光光谱的SAF 检测技术已在多种疾病上显示出其独有的优势及作用。本文对其在皮肤病诊断中的应用做出总结，并介绍了该技术在有AGEs累积的其他系统疾病中的应用。

1 炎症性皮肤病

1.1 银屑病

银屑病是最常见的慢性炎症性皮肤病之一，由炎症及自身免疫共同介导［5］，典型的病理表现为角质形成细胞的异常增殖和功能障碍，树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润及新生血管形成［6］。Bissonnette 等［7］及Wang 等［8］分 别 使 用 波 长442 nm 及（405±10）nm 的激发光照射银屑病患者病变及非病变部位的皮肤发现，病变部位皮肤的发射光光谱中在635 nm处有一荧光发射峰，且其峰值荧光强度与银屑病病变严重程度呈正相关（r=0.627 5，P=0.002），而非病变部位的皮肤和其他皮肤病患者无此峰值；产生荧光发射峰的原因是患者病变部位的鳞屑中原卟啉Ⅸ（protoporphyrinⅨ，PpⅨ）的水平升高。因此，SAF 检测可作为银屑病诊断及疗效评估的工具。

1.2 特应性皮炎

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，以剧烈瘙痒和湿疹为主要表现，可发生于所有年龄段，但在儿童中高发（儿童患病率15%～20%）［9］。目前尚无公认的诊断AD的组织或血液生物标志物，主要依靠临床表现、家族史和既往病史诊断。但对于部分临床表现不典型的患者，尤其是婴幼儿，皮损处有时表现为苔藓样改变，易与银屑病混淆而造成误诊，需要通过皮肤活检方可鉴别这2类疾病［10-11］。Yim等［12］发现这2类疾病的病变部位在408 nm波长的激发光下产生的荧光光谱有显著不同：AD患者病变部位的SAF在620 nm、530 nm和470 nm波长处的荧光强度及总体荧光强度均低于非病变部位（P=0.000 8，P=0.000 7，P=0.000 5，P=0.000 3），并在620 nm、530 nm波长处的荧光强度及总体荧光强度低于健康对照（P=0.000 0，P=0.000 0，P=0.000 0）；而银屑病患者病变部位的SAF在620 nm波长处的荧光强度显著高于健康对照（P=0.011 9），但在530 nm和470 nm波长处的荧光强度及总体荧光强度均与非病变部位和健康对照差异无统计学意义；这可能是AD患者病变部位水肿和表皮中的海绵状变性、真皮炎症细胞浸润导致内源性荧光团（例如角蛋白和胶原蛋白）的含量降低所致。因此，SAF检测可为无创鉴别这2类疾病提供思路。

1.3 接触性皮炎

接触性皮炎指皮肤黏膜接触某些外源性物质后，在接触部位发生的急慢性炎症反应。根据发病机制的不同可将其分为刺激性接触性皮炎（irritant contact dermatitis，ICD）和变应性接触性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）。目前，临床上主要根据病史、临床表现及斑贴试验等区分。ICD 患者多自觉灼痛，而ACD 患者则以皮损处瘙痒为主要表现，但ICD 和ACD 的皮损均边界清晰，而且同一患者可能同时存在ICD 和ACD，因此仅从病史及临床表现上鉴别较为困难；而斑贴试验操作复杂、耗时长，且目前尚无明确的生物标志物可辅助诊断［13］。Shin 等［14］发现使用408 nm 激发光照射CD 患者的病变部位及正常皮肤组织，不论是ICD 患者还是ACD 患者，病变部位产生的荧光强度都低于正常皮肤，这可能与角质层破坏和真皮层的炎症浸润有关；而ICD 和ACD 病变部位的荧光强度无明显差异，说明单纯SAF检测在鉴别这2种类型的皮炎上尚存在局限性。而在斑贴试验结果可疑时，临床医师可通过观察斑贴试验检测部位在408 nm 激发光产生的荧光照片对结果进行判定（阳性标准为照片的4 个角中3 个及以上或整张照片面积的50%～70%以上颜色较深），从而提高诊断的准确性［15］。

2 皮肤伤口愈合

皮肤伤口愈合是一个由多种细胞及细胞因子参与的复杂过程，涉及炎症反应、上皮化、肉芽组织形成、血管再生、伤口收缩和基质重塑等［16］。目前临床评估伤口愈合除肉眼观察大体表现外，常需进行组织活检、针吸等侵入性操作，这可能会导致进一步的组织损伤和伤口延迟愈合［17］。Wang 等［18］建立了体外人皮肤创面愈合模型，伤口部位真皮层中胃蛋白酶分解的胶原交联产生的自体荧光［λEX（335 nm）/λEM（390 nm）］可定量评估伤口大小、闭合程度和间隙，而分布于表皮层的色氨酸产生的自体荧光［λEX（295 nm）/λEM（340 nm）］可评估表皮细胞增殖和定量评估上皮化的状态。尽管上述实验为体外实验，但为SAF检测技术应用在无创性评估人体皮肤伤口愈合程度提供了思路。在基质重塑阶段，伤口处的细胞外基质大量合成并沉积，形成瘢痕。Zhao等［19］在体外实验中比较了瘢痕患者的全厚皮片和瘢痕活检组织发现，在488 nm激发光下，瘢痕组织的荧光强度在548 nm 处达到峰值（176.71±20.69），而正常皮肤真皮乳头层及网状层在该波长处的荧光强度分别为103.91±15.23和169.24±9.18；使用荧光显微镜观察瘢痕切片可在自体荧光背景下清楚地显示胶原纤维的结构，包括其松散度、厚度、边界、大小和形态差异，这可为伤口愈合后瘢痕组织的纤维化程度评估提供一个简单有效的方法和指标。Viktoriya等［20］通过测量正常瘢痕、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩患者瘢痕部位及正常皮肤中的自体荧光强度，发现脂褐素［λEX（535 nm）/λEM（585 nm）］的减少可作为诊断瘢痕疙瘩的指标之一，并获得高达81.8%的敏感度和93.9%的特异度。由于瘢痕疙瘩患者的正常皮肤中也存在脂褐素含量的降低，因此SAF检测还可以运用于术前预测瘢痕疙瘩形成的风险并指导手术方案的制定。

3 皮肤老化及光老化

皮肤随着时间流逝逐渐变化的过程为时序老化，同时皮肤长期暴露于外界紫外线环境产生的老化，被称为光老化［21］。皮肤时序老化及光老化均表现出表皮内角质形成细胞增殖减少、表皮-真皮交接处变平、黑素细胞减少、色素沉着及色素不均，真皮内胶原蛋白生成减少及弹性纤维结构破坏等［22］。

3.1 时序老化

时序老化在295 nm 激发光下产生的发射光的荧光强度降低，与表皮内角质形成细胞增殖减少所致的色氨酸含量减少有关，而在335～340 nm 激发光下产生的发射光的荧光强度增加，与胃蛋白酶分解的胶原蛋白增加有关［23］。Na 等［24］在对人体无紫外线暴露的臀部皮肤的色素沉着及发红进行校正后发现，其在λEX（330 nm）/λEM（375 nm）时的荧光强度与年龄呈正相关（r2=0.25，P=0.002）， 每 年 增 加 约2%； 而 在λEX（370 nm）/λEM（455 nm）时的荧光强度则与年龄无关，此处的荧光主要由胶原酶分解的胶原蛋白交联产生［25］。然而，Sandby-Møller 等［26］采用同样的方法发现，受试者的前额、前臂背侧、肩膀及臀部皮肤在λEX（370 nm）/λEM（455 nm） 时的荧光强度均与年龄呈正相关（r2=0.08～0.26，P<0.001），而上述部位皮肤在λEX（330 nm）/λEM（370 nm）时则没有这种年龄依赖性。这些研究的结果并不完全一致，但总的来说，年龄会导致胶原蛋白交联相关的SAF 增加。因此，SAF 技术未来可用于校准或量化皮肤老化，如非侵入性地监测糖尿病等疾病相关的皮肤过早老化等。

3.2 光老化

皮肤长期暴露于紫外线会诱导激发光谱中270 nm和305 nm 处的新荧光团的出现，这可能与慢性光损伤和炎症反应相关［23］。急性紫外线A （ultraviolet A，UVA）暴露则表现为激发光谱中295 nm 处荧光强度增加而335 nm 处荧光强度降低，这种变化代表对光暴露的急性反应［4］，且其先于组织学改变，可用于急性光损伤的早期评估。Togsverd-Bo 等［27］对30 位器官移植后的患者进行分析发现，在370 nm 处激发的荧光强度与紫外线暴露程度及皮肤光损伤导致的晒斑的密度有关，因此该处的荧光强度可作为临床上客观量化光损伤的指标，并可为器官移植后患者的光老化加速提供可靠的预测指标。

4 皮肤恶性肿瘤

皮肤恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）及非黑色素瘤皮肤癌（non-melanoma skin cancer，NMSC），其中NMSC 又分为鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC） 和基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）等类型。由于肿瘤细胞和周围正常皮肤细胞的增殖分化以及代谢明显不同，因此肿瘤组织与正常皮肤的SAF 存在差异，可辅助诊断皮肤恶性肿瘤。外源性光敏剂在皮肤恶性肿瘤临床显像中已有应用，如PpⅨ可作为NMSC 检测和光动力疗法的光敏剂。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是PpⅨ的可溶性前体，局部外敷含ALA 的乳膏约3 h 后，ALA 可被有核细胞吸收并经血红素合成途径转化为PpⅨ；肿瘤组织内的血红素合成相对较高，因此积累了更多的PpⅨ并得以与正常组织区分［28］。而Na等［29］证明BCC病变部位的皮肤在370 nm 激发光下产生的SAF在455 nm 处达到峰值，其峰值荧光强度较正常皮肤明显降低（P<0.001），可能与NADH、胶原蛋白、弹性蛋白等荧光团的减少有关，可以代替PpⅨ诱导的荧光对肿瘤边界进行界定。由于SAF 可直接测量而无需提前施用外源性光敏剂，因此可减少肿瘤切除的术前准备时间。Brancaleon 等［30］检测了BCC 及SCC 患者病变部位的SAF 强度发现，在295 nm的激发光下，肿瘤部位色氨酸残基引起的荧光强度比正常皮肤组织高，这是肿瘤部位表皮细胞功能活跃或过度增殖所致；相反，在350 nm 激发光下，肿瘤部位与真皮的胶原蛋白交联有关的荧光强度通常比正常组织低，这可能是肿瘤细胞释放的酶导致结缔组织的降解或侵蚀所致。此外，由于皮肤肿瘤血供相对丰富，血红蛋白对荧光有吸收作用，在410 nm 激发光下，NMSC 患者病变部位的皮肤比周围正常组织产生的荧光强度更低［31］。根据NMSC 部位和正常皮肤在上述波长位置产生荧光强度的不同，SAF 技术可帮助临床医师进行诊断。使用K-邻近（K-nearest neighbor，K-NN）算法分析SAF光谱可以区分不同病因导致的赘生性或炎性病变，包括浅表BBC、结节性BCC、鲍恩病和银屑病，均可达到92%以上的特异度和灵敏度；但此种算法需将未知光谱与已知光谱的数据库进行比较，因此需要事先建立较大的数据库方可获得较高的准确度［32］。综上，SAF 检测技术可用于NMSC的辅助诊断。对于MM，Lihachev 等［33］发现其在405 nm发光二极管（light emitting diode，LED）照射下产生的SAF三原色（red green blue，RGB）图像的荧光强度明显低于BCC 和色素痣，但需要扩大临床病例数确定其是否存在统计学差异。Wang 等［34］使用近红外荧光成像对蓝痣、脂溢性角化病、皮内痣及恶性雀斑样痣（MM 的癌前病变）进行分析发现，通过黑素荧光分布的不同特点可区分这几类皮肤病。此外，Tamošiūnas 等［35］研究皮肤癌术后瘢痕内SAF 的增长趋势，认为瘢痕SAF 的暂时减少可能是皮肤癌局部复发的标志，因此推测SAF 检测可以应用于皮肤癌的长期随访和复发的早期评估。

除了单独运用SAF 检测技术诊断外，SAF 检测也可联合其他检测方式以提高诊断的准确度。使用SAF 和δ-氨基酮戊酸诱导荧光相结合的双光谱成像方法检测得出的侵袭性BCC 的肿瘤边界，比单独使用δ-氨基酮戊酸诱导荧光成像更接近实际的肿瘤边界［36］。使用SAF对PpⅨ荧光检测进行归一化处理后（灵敏度97%，特异度100%），对NMSC 定位的准确性比单独使用PpⅨ荧光检测明显升高（灵敏度27%，特异度39%）［37］。而使用拉曼光谱、可见光激发的SAF 光谱和近红外光激发的SAF 光谱等3种光谱联合分析，通过对BCC、MM患者病变部位皮肤与正常皮肤的黑素、卟啉、黄素、脂质和胶原蛋白含量等多项指标进行分类，可达到97.3%的分类准确率，适用于肿瘤的快速分类和大规模筛查［38］。Khristoforova等［39］同样联合SAF光谱及拉曼光谱，通过变量投影重要度（variable importance in projection，VIP）分析及偏最小二乘法（partial least square，PLS）回归分析，可良好地区分MM、BCC 及其他皮肤良性肿瘤（皮肤纤维瘤、血管瘤、角化病等）。

5 有AEGs累积的其他系统的疾病

除皮肤病外，SAF 检测技术可用于无创评估皮肤中AGEs 的累积以辅助其他系统疾病的诊断［40］。AEGs 是非酶糖基化反应的终产物，在组织中的累积与许多年龄相关的慢性疾病发展有关，如动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾功能衰竭、阿尔茨海默病等。SAF 检测设备（如AGE-ReaderTM）通常使用300～420 nm 的激发光照射前臂的皮肤区域，并用分光光度计收集并检测皮肤内源性荧光团产生的420～600 nm 发射光的荧光强度，通过计算及标准化得出SAF 强度［41］。目前SAF 检测在临床中已运用在内分泌系统、泌尿系统、心血管系统、神经系统等系统疾病的诊断。例如，SAF 可用于糖尿病高危人群的风险分级，为糖尿病检测提供评估工具［42］。AGEs 在肾脏病患者中也有累积，尤其与慢性肾脏疾病的预后相关［43］。急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）患者的SAF 低于慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者，并且与预期的肾衰竭持续时间有关，因此早期测量SAF 有助于区分AKI 和CKD［44］。SAF 还可作为心血管疾病高风险患者全因死亡率和心血管病死亡率的预测指标［45］。在神经认知功能方面，轻度认知功能障碍患者的SAF 明显高于正常认知功能受试者的SAF（2.56±0.55 vs 2.10±0.41，P<0.001），而高SAF（SAF>2.27）与轻度认知障碍存在显著相关（odds=6.402，P=0.009）［46］，因此SAF 有望作为轻度认知障碍的诊断工具。另外，SAF 与尿液中可替宁N-氧化物（一种尼古丁暴露的生物标志物）的浓度呈正相关（β=0.06，P=0.03），可代替问卷作为简易评估尼古丁暴露程度的工具［47］。在评估其他系统疾病时，SAF 主要作为AGEs 的定量评估工具，因此其应用均为AGEs 相关的疾病。总而言之，SAF 技术在评估AGEs的组织累积上已十分成熟，并且可在多系统疾病的诊断中发挥作用。

6 结语与展望

SAF 检测技术具有无创、便捷、成本低等优点，此外由于SAF 检测不需要注射外源性荧光团（即光敏剂），可避免光敏剂类型及剂量选择、光敏剂施加至检测间隔时间的设定及光敏剂不良反应等问题［48］。但是，SAF 检测目前仍有许多局限性：①不同性别及人体不同部位的SAF 强度基线不同［49］，因此需对不同性别及检测部位的SAF 强度进行标准化。②皮肤表皮层的黑素及真皮层内的血红蛋白均会吸收荧光［24，26，50］，较深肤色（Fitzpatrick皮肤分型为Ⅴ型和Ⅵ型）的皮肤易吸收激发光使皮肤反射率（skin reflectance percentage，SR%）低于6，导致SAF 无法准确测量［32，41，43］，因此SAF 检测的结果需要对皮肤色素沉着及发红进行校正。③SAF 检测还受护肤霜的影响，导致SAF 相关数值测量误差升高和SR%降低，这可能是由于护肤霜吸收紫外线辐射保护皮肤的特性所致［51］。④内源性荧光团的激发和发射光谱较宽，可能会出现光谱重叠使不同荧光团难以区分。尽管如此，SAF成像及荧光光谱技术仍在多种疾病的诊断上显示出其特有的优势。例如：无创性操作及低成本可提高患者的接受度或治疗后随访的依从性；在术前无需患者接受额外的光敏剂注射即可在术中指导术者肿瘤切除的范围，减少医患双方围术期的准备工作等。

目前SAF 检测技术在临床上尚未大规模应用，原因可能是采集病例数据库较小、没有一致的统计算法和缺乏统一的判定标准，使研究结果缺乏可推广性。进一步扩大研究的样本量并规范算法及阳性结果的判定标准仍然是未来需要解决的问题。随着自体荧光检测技术的不断发展和数据库、算法、评判标准的不断完善，SAF 检测技术在疾病诊断中的应用会越来越广。