黄芩苷抗肿瘤作用机制的研究进展

刘梦珂，纪濛濛，程 林，黄金艳，孙晓建，赵维莅，王 黎

上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科，上海市血液学研究所，医学基因组学国家重点实验室，国家转化医学研究中心，上海200025

传统中药治疗肿瘤的研究已引起广泛的关注。中药疗法作为放射疗法和化学疗法（化疗）的辅助治疗，在提高患者生存质量和生存率方面取得了显著的成效［1］。黄芩苷作为中药黄芩的主要有效成分之一，具有良好的抗氧化、抗炎症、抗病毒和抗肿瘤的作用。研究［2］表明，黄芩苷能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，防治肿瘤转移。目前，已有研究发现其在肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、白血病和淋巴瘤等疾病中具有辅助治疗的作用。本文就黄芩苷对肿瘤的影响及主要机制进行总结，以期为应用黄芩苷治疗肿瘤的思路提供参考。

1 黄芩苷对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响

1.1 阻滞肿瘤细胞周期

研究［3-4］发现，黄芩苷具有阻滞细胞周期和抑制肿瘤细胞增殖的作用。细胞周期是细胞增殖中遗传物质复制和细胞分裂的过程，主要由G0/G1、S、G2、M 期组成。细胞周期受调节基因和多种调控蛋白的影响，如周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）、周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclindependent-kinase inhibitor，CKI）［5］。经黄芩苷处理后的结肠癌细胞HCT116、HT29 和SW480，G0/G1期细胞数量减少，多数细胞周期停滞于S期，且黄芪苷的剂量越高阻滞效果越明显［3］。在肺癌细胞Hep G2 和SMMC-7721 中，黄芩苷同样引起S 期停滞；且进一步实验［4］发现，经黄芩苷处理后G1期cyclin D1 表达下调，推动细胞分裂由S期向G2/M 期转化的促分裂因子cyclin A 和CDK2 均随黄芩苷剂量的增加而降低，也说明了黄芩苷有阻滞肿瘤细胞周期的作用。

1.2 促使肿瘤细胞衰老

诱导细胞衰老是抗肿瘤的手段之一。研究［6-8］表明，黄芩苷能够促使肿瘤细胞衰老。细胞衰老是细胞增殖分化能力下降的生理过程，主要分为2种类型：①复制性衰老，与端粒缩短相关。②外源性衰老，与一系列外源性因素，如氧化应激、DNA 损伤、某些特定原癌基因的激活以及炎症因子、趋化因子的作用相关［9］。Ren 等［6］研究发现，在白血病细胞HL-60 中，经黄芩苷处理后的C-MYC 基因相关的mRNA 和蛋白表达水平，以及人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的mRNA 表达水平均下降。C-MYC 能够结合到目标基因，如hTERT的启动子区域，启动hTERT 的转录，从而参与端粒酶的调节，与肿瘤细胞增殖衰老相关。黄芩苷能降低hTERT 基因在肿瘤细胞中的表达，抑制端粒酶活性，诱导HL-60 细胞衰老和凋亡［6］。另外，黄芩苷能够降低肿瘤细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水 平， 提 高 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）水平，造成低氧环境，上调结肠癌细胞HCT116 中低氧应答的孕酮诱导蜕膜蛋白（decidual protein induced by progesterone，DEPP）的水平。DEPP分子在低氧条件下能增强丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号的磷酸化，提高RAF1 和ERK 分子的表达水平，激活Ras/Raf/MEK/ERK 以及p16INK4a/Rb 信号通路，导致肿瘤细胞衰老［7］。原癌基因诱导的衰老是一种由高表达原癌基因促进细胞快速增殖，加速细胞周期提早发生衰老的机制，在正常细胞和早期癌症中具有监视和清除肿瘤细胞的作用。有报道［8］称，Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路的上游原癌基因Ras在低表达时促进肿瘤发生，而在过表达时激活抑癌通路，产生不可逆衰老，如p16INK4a基因。

1.3 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是调节正常组织稳态，清除损伤、衰老和被感染细胞的细胞程序性死亡，分为细胞表面死亡受体介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径。外源性途径可由细胞表面受体和配体结合而诱导，如肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）结合，Fas（CD95/APO-1）与Fas 配体（Fas ligand，FasL）结合等［10］。内源性途径的激活可由低氧、遗传物质损伤、细胞质高Ca2+浓度、辐射和化学药物等诱导线粒体损伤而产生［10］。内源性凋亡的机制为B 细胞淋巴瘤2 蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）家族中促凋亡的Bcl-2 相关蛋白X（Bcl-2 associated X， Bax）、 Bcl-2 拮 抗 蛋 白（Bcl-2 antagonist killer，Bak）和家族中的抗凋亡蛋白（如Bcl-2）结合，导致线粒体膜破裂，膜内凋亡因子（如细胞色素C）释放到细胞质，诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9前体（pro-cysteine-containing aspartate-specific protease 9，pro-caspase-9）自身活化和蛋白酶水解，激活下游caspase-3、caspase-6、caspase-7，导致细胞凋亡［10］。研究［11-12］发现，黄芩苷主要影响肿瘤细胞内源性凋亡，通过多种信号通路影响Bcl-2家族蛋白、细胞色素C、caspase-3、caspase-9等蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。

1.3.1 下调Bcl-2 蛋白启动内源性凋亡 卵巢癌模型中，黄芩苷使得Bcl-2 家族蛋白中的抗凋亡蛋白表达降低，同时caspase-3 剪 切 体 （cleaved-caspase-3） 和cleavedcaspase-9 表达升高，提示其通过激活caspase 相关信号通路诱导细胞凋亡［11］。Wang 等［12］在消化道肿瘤中同样发现，黄芩苷能诱导Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA 表达升高和Bcl-2 表达降低，在细胞凋亡的线粒体通路中有重要作用。

1.3.2 抑制肿瘤细胞内信号通路诱导内源性凋亡 在白血病和淋巴瘤中，黄芩苷均能够通过抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT 信号通路诱导凋亡［13］。在淋巴瘤细胞CA46 中，黄芩苷不仅能降低AKT 的表达，而且能够抑制AKT 及其下游信号的磷酸化水平，降低核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平，提高NF-κB抑制剂（inhibitor of NF-κB，IκB）水平。细胞质中抗凋亡作用的NF-κB 与其抑制剂IκB 形成复合体，表现为失活状态；而活化的AKT 可诱导IκB 磷酸化并使游离的NF-κB 入核，启动抗凋亡基因的转录。黄芩苷抑制PI3K/AKT/NF-κB通路从而诱导内源性凋亡，依次裂解pro-caspase-9、pro-caspase-3 和核糖聚合酶并降解DNA［14］。

非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC） 中，黄芩苷上调去乙酰化酶1 （sirtuin 1，SIRT1） 基因的表达和AMP 活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase， AMPK）的磷酸化水平，SIRT/AMPK 信号在NSCLC 细胞中表达为抑癌基因通路，AMPK 的激活能够抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）的磷酸化，而磷酸化的mTOR 可抑制细胞凋亡相关的caspase 通路和自噬。因此，激活SIRT/AMPK 通路，增加了NSCLC 的细胞凋亡［15］。

1.3.3 增加肿瘤细胞内Ca2+含量诱导内源性凋亡 在恶性胶质瘤细胞U87 和U251 中，黄芩苷能够增加细胞内Ca2+含量，Ca2+在细胞自噬和凋亡过程中均有作用。高浓度Ca2+可升高多腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADPribose）polymerase，PARP］、Bax 和cleaved-caspase 3 水平，促进细胞凋亡［16］。

1.3.4 作用于肿瘤原癌基因诱导内源性凋亡 黄芩苷也能作用于RNA，通过致癌微RNA（oncogenic microRNA，oncomiRNA），诱导凋亡。Tao 等［17］在对结肠癌的研究中发现，黄芩苷能够抑制oncomiRNA 诱导细胞凋亡。对黄芩苷处理后的细胞进行RNA 芯片检测显示，37 种oncomiRNA 的 表 达 降 低， 包 括miR-10a、 miR-23a、miR-30c、miR-31、miR-151a 和miR-205 等。通过基因本体数据库（Gene Ontology，GO）对这些miRNA和其靶基因功能分析发现，许多凋亡相关通路如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路、p53 信号通路等的表达显著增强，且进一步研究发现黄芩苷通过抑制原癌基因c-MYC的蛋白表达，下调oncomiRNA水平，诱导细胞凋亡。另外，有研究［18］发现，黄芩苷通过miR-217/Dickkopf 1（DKK1）抑制Wnt/β-catenin信号通路和下游的c-MYC mRNA表达，从而诱导细胞凋亡。

2 黄芩苷对肿瘤侵袭与转移的影响

2.1 抑制上皮间质转化

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤的形成和转移过程中具有重要的作用。上皮细胞与基底膜黏附降低并向间质细胞转化，诱导肿瘤迁移和入侵。这一过程是由多种信号通路（包括Wnts、Notch、TGF-β等）介导的［19］。

在乳腺癌细胞中，黄芩苷通过抑制TGF-β 通路介导的EMT 来抑制肿瘤转移。TGF-β 结合相应受体TβRⅠ、TβR Ⅱ和TβR Ⅲ，激活转录因子，产生钙黏蛋白（cadherin）亚型的转化。在EMT过程中，E-cadherin表达降低，N-cadherin 表达升高，TGF-β1 激活转录因子snail、slug、twist，以及E 盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box binding protein 1，ZEB1）、ZEB2［20］。黄芩苷能使乳腺癌细胞MDA-MB-231 和4T1 中的上皮细胞标志物E-cadherin和密封蛋白（claudin）表达上调，间质细胞标志物Ncadherin 和波形蛋白（vimentin）以及相关的转录因子snail、slug 下调。进一步实验［21］表明，黄芩苷还能通过抑制p38MAPK 和β-catenin 信号通路实现抑制EMT 和肿瘤转移的作用。

另外，有研究［22］发现，黄芩苷对TGF-β/Smad 信号通路有抑制作用。在Smad 信号通路中，TGF-β 刺激Smad2 和Smad3 磷酸化，形成Smad2/3 复合体进而诱发EMT。黄芩苷显著抑制了Smad2和Smad3的磷酸化水平，从而抑制TGF-β诱导的EMT。

2.2 抑制细胞外基质和基底膜降解

肿瘤侵袭与转移的环节包括细胞外基质和基底膜降解等。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是降解细胞外基质的唯一一类蛋白水解酶，与基质重塑、介导肿瘤血管新生相关，其中MMP-2和MMP-9在肿瘤转移中尤为重要［23］。Wang 等［24］通过实验验证了黄芩苷能够通过p38MAPK 通路抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231 中MMP-2 和MMP-9 蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞转移。在宫颈癌细胞Hela 中，同样发现黄芩苷通过抑制p38MAPK 信号通路的活性降低MMP-2、MMP-9 的表达［25］。

3 黄芩苷对肿瘤免疫的影响

3.1 抑制肿瘤免疫逃逸

黄芩苷有抑制肿瘤表面免疫检查点、刺激免疫反应的作用。肿瘤细胞表面对免疫调节有抑制作用的细胞程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）结合细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表面的程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1），抑制CTL 的抗肿瘤效应，造成肿瘤免疫逃逸［26］。研究［26］发现，在黄芩苷治疗后的BALB/c肝癌小鼠模型中，肿瘤组织CD8+细胞数量增加，同时使PD-L1 表达下调。据文献［27］报道，信号转导子和转录活化子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在PD-L1的表达中起作用。而黄芩苷处理的细胞STAT3磷酸化水平下降，提示其可能通过抑制STAT3，下调PD-L1表达。

3.2 激活正向免疫调节

黄芩苷对免疫微环境的影响也体现在调节细胞因子水平，如降低TNF-α、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-10 等水平和升高IL-2 水平。在乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 和 接 种MDA-MB-231 细 胞 的BALB/c 小鼠血清中，黄芩苷能够降低TNF-α 和IL-1β 的浓度。TNF-α 和IL-1β 通过结合细胞膜特异性受体，调节NF-κB 通路，发挥促炎症反应的作用［28］。在肺癌细胞A549和H1299中，黄芩苷也能降低尼古丁诱导的TNF-α、IL-6 水平［29］，通过抑制癌症中的相关炎症反应，减缓肿瘤的发生发展。在儿童急性淋巴细胞白血病的研究［30］中，黄芩苷有增加外周血白细胞中γ 干扰素（interferonγ，IFN-γ）分泌，降低骨髓细胞中TNF-α 和IL-10分泌的作用。另外，BALB/c 肝癌小鼠模型中也发现黄芩苷使得IL-2水平升高，对T细胞的活动有正向调节作用［26］。

此外，黄芩苷对免疫微环境的影响在其他炎症模型及自身免疫性疾病中也得到证实。黄芩苷有通过表观遗传影响炎症反应的作用。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC） 被证明具有抑制炎症因子（如IL-1β，TNF-α）的作用，而组蛋白甲基化修饰可招募NF-κB 促进促炎基因的表达，与慢性炎性疼痛的发生有关。在诱发神经性疼痛的小鼠模型中，黄芩苷通过调控组蛋白的乙酰化修饰减少炎症因子的表达，从而抑制神经痛的发生。并且黄芩苷能抑制HDAC1 磷酸化，直接通过翻译后修饰影响HDAC1 蛋白的结构，降低HDAC1 的表达，抑制炎症反应［31］。在自身免疫性疾病中，黄芩苷调控调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg cell）和效应性T 细胞（effector T cell，Teff cell）的平衡，增加Treg细胞的数目，减少Teff 细胞数目，抑制CD4+T 细胞的增殖，减少细胞因子的释放，从而抑制免疫反应［32］。这些免疫调节的过程在黄芩苷抗肿瘤作用中具有重要的意义，也为进一步探索黄芩苷对肿瘤微环境的影响提供了新的思路。

3.3 激活宿主固有免疫

黄芩苷对固有免疫有激活作用。在儿童急性淋巴细胞白血病中，当患者感染了水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），由于体内IFN 产生缺陷导致VSV复制水平升高。黄芩苷能激活固有免疫，升高IFN-α/β，促进自然杀伤细胞（natural killer cell， NK cell）的非特异性抗病毒作用，降低VSV的效价［30］。

3.4 诱导肿瘤相关巨噬细胞复极化

黄芩苷能诱导肝癌细胞中肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophage，TAM）的复极化。TAM 是肿瘤微环境中影响肿瘤细胞增殖、侵袭及相关免疫反应的一类重要细胞，分为2 种类型——M1 型和M2 型，其中M2 型占主导成分。M1 型巨噬细胞能促进吞噬、清除肿瘤细胞、抑制肿瘤的发展；M2 型巨噬细胞有免疫抑制和促进肿瘤血管新生的作用［33］。黄芩苷通过诱导TAM 自噬，使M2 型巨噬细胞向有着抗肿瘤作用的M1 型巨噬细胞复极化。文献［34］报道，自噬相关的RelB/p52 通路有调控Th1、Th2 表型的作用。在黄芩苷的处理下，转录因子RelB 被抑制，M2 型巨噬细胞下调，促进肿瘤细胞的清除。

4 黄芩苷与其他抗肿瘤药物的协同作用

黄芩苷除了有直接的抗肿瘤作用外，还可通过与其他抗肿瘤药物协同作用，增强抗肿瘤药物的效果，从而抑制肿瘤的发展。黄芩苷具有下调HL-60/ADM 细胞中多药耐药相关蛋白1 （multidrug resistance-associated protein 1，MRP1） 和肺耐药相关蛋白（lung resistance-associated protein，LRP）表达的作用，与阿霉素协同，逆转细胞耐药，从而增强阿霉素疗效，促进细胞凋亡［35］。另外，有研究［36］发现，在间皮瘤细胞MESO924 中，黄芩苷能够通过阻滞PI3K/AKT/mTOR信号通路，与化疗药物协同作用，增强化疗药物如阿霉素、顺铂、培美曲塞的药效。

5 结语与展望

随着研究者们对中医药抗肿瘤机制的关注，黄芩苷这一有效成分的药效和机制的研究越来越多。学者们证明了其在阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移、促进免疫反应和诱导肿瘤细胞自噬等方面的作用。但黄芩苷抗肿瘤的作用机制及对肿瘤微环境的影响仍值得进一步探索，以期为其临床应用提供新的思路，对恶性肿瘤的辅助治疗有所帮助。