石蜡切片操作规范性的进展研究

河南省医疗器械检验所 国家药监局医用生物防护及植入器械质量评价重点实验室（450000）陈国铭 周静 田林奇 魏聪 周小婷 何孜翰 柳小军

一张良好HE染色切片，是教学、科研以及病理诊断中不可缺少一项环节[1]。随着病理技术快速发展，新设备问世极大减少了病理技术相关工作者手工操作，且新技术应用充实病理诊断方式，提高诊断准确性，但最常规、最重要、最基础仍旧为石蜡切片技术[2]。石蜡切片技术属于临床中常见的制片技术，其应用在正常组织细胞观察，同时广泛应用至病理学研究以及疾病诊断等多个方面，存在成本低、保存时间长以及直观性强等优势[3][4]。石蜡切片技术是医学生在学习组织学中必须掌握的一项实验技术，可对学生后期从事病理诊断、检验技术等多个工作打下坚实基础。石蜡切片制作过程具体为取材、固定、脱水以及透明、浸蜡、包埋等步骤[5]。笔者结合相关文献以及实验室实践经验、体会，对石蜡切片的制作过程中部分措施予以改善，同时总结制作期间注意事项。

1 甲级组织脱水、HE染色、石蜡切片标准

1.1 组织脱水、包埋后优质蜡块标准 无凹陷、混浊；组织无缺损、斜坡；无气泡、白点。

1.2 优质切片标准 切片厚薄适度且无缺损；不掉片、无裂纹、无刀痕、无皱褶；无气泡且捞片位正。

1.3 优质HE染色标准 着色适中且色泽鲜艳；染色质为颗粒状，且清晰透明；封片无溢胶、切片无污染，且无气泡；编号正确、位正、标签清晰。

2 取材、固定

2.1 流程如下 ①结合实际要求选择动植物材料；结合具体要求将组织切为小块，一般为5mm×5mm×2mm，分别对应长、宽、高；②将切好组织块投至浓度为4%多聚甲醛溶液内予以固定，固定时间为24h左右。

2.2 注意事项具体如下 ①取材新鲜，部位准确；②一次性完成切割组织，切勿挤压组织；③保持取材组织表面洁净，不应有毛发、血液等；④于使用前现配固定液，且确保量充足；⑤组织若无法得到充分固定，制作完成切片随时间延长出现自溶、腐败等状况。鉴于此，于固定时可于瓶底放置几层纱布避免组织和瓶底出现直接性接触，确保固定液由各个角度均匀渗入至组织内部；⑥针对较为柔软的器官，固定时若仅单纯整个放置于固定液内，固定用时较长，且若器官相对较大，可能导致内部固定不全或者不充分等不良结果，故可先将大块组织投至固定液内固定，待2～3h后组织出现硬化后，将大块组织切为小块，后将小块组织再投至固定液内。

3 脱水、透明

3.1 流程如下 ①组织块在固定24h后，取出并经自来水予以冲洗，然后分别使用30%、50%、70%、85%以及95%乙醇溶液对组织块实施脱水处理，每次处理时间约30min，最后经无水乙醇对组织块进行脱水3次，每次1h；②组织透明时选用二甲苯作透明剂，首先将脱水后组织放至二甲苯与无水乙醇各半混合液内，于1h后转入到二甲苯内浸渍。

3.2 注意事项具体如下 ①乙醇具有较强挥发性，应在组织脱水之前进行现场配制，且于脱水前与脱水期间将装有乙醇溶液容器封闭；②逐步进行组织脱水步骤，不可直接性由高浓度乙醇开始，此外，组织在乙醇溶液内不宜浸泡过长时间，否则可产生过度脱水状况，引起组织硬脆、收缩；③待组织浸泡至二甲苯之后，若产生白色云雾状现象，说明组织尚未完全脱水，需要重新脱水；④严格控制组织浸入二甲苯时间，若时间过短可致使组织透明不够彻底，导致后期难以浸入石蜡，相反，时间过长，可致使组织硬脆，切片为“豆腐渣”样；⑤二甲苯具有较强挥发性，且存在毒性，故在组织透明期间应于通风窗口处实施；⑥脱水时，可先用滤纸吸收组织块周围水分，后再将组织块放置乙醇溶液中，可提高脱水效率；⑦在透明期间，可先用纱布包裹组织，后浸至二甲苯中，待进入后，应用载玻璃片压在其上方，以确保组织完全浸入至透明剂中。

4 浸蜡、包埋

4.1 流程如下 浸蜡目的为石蜡浸入至组织内取代透明剂，与此同时对组织发挥支持效果。①将组织浸入至已融化石蜡与二甲苯等量混合液内，于1h后将组织先后移至2个熔化纯石蜡液浸渍3h；②取出组织块，切面朝下放置在手工小纸盒内，后加满石蜡实施包埋。

4.2 注意事项具体如下 ①如果浸蜡液应用旧蜡与新蜡混合液，新蜡加入量最好≤旧蜡1/3，且应反复实施高温熔化以排出新蜡内气体；②浸蜡温度最好≤65℃，否则过高温度可将组织内抗原破坏，影响病理诊断结果；③需结合组织块大小、种类等严格把控浸蜡时长，如果时间过短，可致使石蜡无法完全浸入组织，导致切片产生不完整状况；如果时间过长，可导致组织产生过度收缩，进而导致切片产生易碎裂状况；④包埋时要求动作迅速，若操作过慢，包埋蜡和组织块之间温差较大，可能导致组织块和蜡无法紧密结合，引起切片困难状况。

5 切片、染色

5.1 流程如下 ①取出包埋好组织蜡块，并将其规整为四棱柱状，后经轮转式切片机切为厚度约4～7μm薄片；②经粘附剂将薄片牢附在载玻片上，后将载玻片放置在45℃温箱内实施干燥，干燥完成后蜡片经二甲苯予以脱蜡，在经梯度酒精以及蒸馏水水化后，使切片可用水溶性染液进行染色；③切片染色多采用HE染色法，经染色后，切片内嗜碱性物被染为紫蓝色，而嗜酸性物被染为粉红色；完成染色后，利用中性树胶实施封片。

5.2 注意事项具体如下 ①切片时极有可能产生切片不成带或者切片上伴有裂纹状况，产生这种状况原因之一为切片机刀片上出现缺口。故为避免产生这种状况，于切片前可于低倍镜下对刀片是否具有欠缺口进行观察；②夏季切片时，为避免蜡块过软，可事先将蜡块放置在冰箱内，等到切片时取出；③苏木精染色液的放置时间较长极易产生结晶，因此在使用前需先过滤将杂质去除，或者重新调配染色液；④在封片时，滴入中性树胶量需适中，盖玻片应先从一侧开始，后慢慢向前盖下，以免产生气泡。

6 小结

以上就优质石蜡切片技术步骤流程提出要求与改善，严格依据操作规范制定可有效实现制片过程全优质标准。优秀石蜡切片制作环环相扣，任意一环节未按照规范操作，最终对染片质量产生不同程度影响。高质量石蜡切片制作是一项要求精细且程序繁琐工作，每一项操作均可直接影响切片质量，要求以科学严谨态度认真对待每一项操作，并准确把握每一个关键点，形成良好习惯。此外，还需虚心向他人学习，互相交流，并予以总结与摸索，形成属于自己一套好方式与经验，同时将理论和实际相结合，依据标准操作流程制作，最终可制作为满意切片。总之，石蜡切片技术是于组织学中一项重要试验技术，仍需不断持续改善，以提高制片效果。