锌对脊髓缺血再灌注损伤保护作用的研究进展

刘智明，尹飞

(吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033)

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)是脊髓缺血缺氧的因素消失，重新恢复血供后，其神经功能不仅没有得到改善，其缺血损伤程度较原水平反而进一步加重，甚至出现脊髓组织神经元不可逆的迟发性死亡的病理状态[1]。血管外科、胸外科和脊柱外科手术因SCII的发生而复杂化，造成一系列并发症，如脊髓功能障碍、术后感觉丧失、运动功能损害(如膀胱和肠道)和不可逆的性功能障碍。这些不良事件给患者及其家属带来了巨大的心理和经济负担[2]。锌是一种人体所必需的微量矿物质元素，在抵抗SCII的多种代谢和信号通路中起着关键作用，在多种新陈代谢和生理功能中也起到了重要作用。此外，锌还是体内300多种酶和许多其他生物因子(包括激素、细胞因子、肽和生物膜)发挥作用所必需的微量元素。由于锌广泛参与蛋白质的组成，对蛋白质发挥其正常功能具有不可或缺的作用，因此锌对于多种生命活动(例如生长发育，免疫应答，基因表达，伤口愈合)也是必不可少的[3]。本文就锌对SCII 的几个保护作用作一综述。

1 SCII的发病机制

据报道，脊柱外科手术和主动脉介入术后最严重的并发症之一就是SCII，并有可能进一步导致迟发性截瘫[4]。SCII的具体发病机制目前尚不清楚，但近年来，对SCII的病因和发病机制的研究主要包括氧自由基介导的脂质过氧化损伤、炎症反应、细胞内Ca2+超载、以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸的毒性作用和细胞凋亡等。

1.1 氧自由基介导的脂质过氧化 自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团，对人体造成伤害的主要是氧自由基。氧化反应是人体进行正常新陈代谢以及给机体供能必不可少的生理过程，但当机体处于病理状态时，机体的抗氧化体系就很难清除氧化反应产生的过多活性氧(reactive oxygen species，ROS)，而过多的活性氧自由基会进行破坏，引起体内各种生物大分子的氧化应激损伤，包括蛋白质、脂质、DNA 和 RNA等，而脂质过氧化损伤被认为是SCII的主要病理机制之一。这些氧化应激损伤会导致人体正常细胞和组织的损坏，是多种心血管、老年性和免疫性等疾病的重要致病因素。

在病理条件下，ROS产生和消除的抗氧化防御系统破坏，导致ROS的生物利用度增加，出现氧化应激状态，进而导致脂质过氧化。氧化应激可导致细胞或组织的氧化损伤，这也是DNA损伤的主要原因。由于体内的DNA修复系统无法修复ROS引起的DNA损伤，导致基因组不稳定或突变，从而导致许多慢性退行性疾病的发生[5]。

SCII的发生过程中，过多的活性氧是引起细胞损伤的一个关键因素。脊髓在缺血过程中，三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)分解产生二磷酸腺苷(adenosine-diphosphate，ADP)、 一磷酸腺苷(adenosine-monophosphate，AMP) 和次黄嘌呤，随后，导致脊髓缺血缺氧的原发病因去除，脊髓组织重新恢复血供，次黄嘌呤代谢产生了大量的氧自由基，这些产生过量的氧自由基可导致脂质过氧化。脊髓组织因为不饱和脂肪酸含量较高，从而对氧自由基导致的脂质过氧化极其敏感，更易受到氧自由基损伤，使膜受体、 膜蛋白酶、离子通道等功能受损，最终导致脊髓组织内的神经细胞不同程度凋亡或坏死。更严重的是，这种损伤不会就此停止而是继续发展，从而造成更严重的后果。此外，氧自由基可导致DNA 和 RNA等遗传物质损伤、刺激众多炎症介质产生，进一步引起神经细胞凋亡，最终导致神经细胞功能障碍，发生SCII[6-8]。

1.2 炎症反应 有研究证实[4]，炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1b(interleukin-1b，IL-1b)和白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)，是多种中枢神经系统疾病的主要介质。这些炎症细胞因子通过继发性损伤或炎症反应在SCII中也起了重要作用，很容易导致神经细胞凋亡或死亡。

Zhang等[9]研究发现，SCII发生后，由于氧化应激和血脊髓屏障的破坏，中性粒细胞和神经胶质细胞高度活化和动员，可能通过触发核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)进一步增加各种促炎细胞因子来启动炎症级联反应。因此，他们通过初步检测中性粒细胞浸润的最佳标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，发现SCII后MPO、TNF-α和NF-κB水平都有不同程度的升高。这进一步说明炎症反应参与了SCII的发生与发展。

1.3 细胞内Ca2+超载 SCII发生后，被活性氧损伤的细胞膜通透性增加，从而引起大量 Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度急剧升高。此外，SCII发生后，细胞内 Na+-K+-ATP酶失活，细胞内 Na+浓度升高，K+浓度降低，细胞内高浓度的 Na+能够促进 Na+与Ca2+的交换，使细胞内的Ca2+浓度进一步升高。Sun等[10]研究发现，大鼠脊髓神经元细胞膜、胞浆以及突起部位均分布有钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)和钙蛋白酶。SCII后，CaSR 通过释放细胞内Ca2+库和促使细胞外Ca2+内流，从而提高细胞内Ca2+浓度。以上因素使细胞内Ca2+达到一定浓度后，就能够激发钙蛋白酶活性，从而降解神经元细胞骨架及结构蛋白，引起细胞损伤，最终导致神经功能障碍。

1.4 以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸的毒性作用 谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质，在神经激活中起主要作用。谷氨酸/胱氨酸转运体(glutamate/cystine transporter)主要分布于星形细胞和神经元，生理状态下释放1分子的谷氨酸，并摄取1分子胱氨酸入胞，两者相偶联[11]。有学者报道 SCII 后，缺血缺氧导致细胞 ATP 合成减少，细胞膜表面的Na+-K+-ATP 酶功能受损，导致 Na+大量外流，组织间谷氨酸浓度升高，谷氨酸大量堆积，引起细胞摄取胱氨酸受到抑制，胞内谷胱甘肽合成减少，氧自由基大量堆积，通过刺激神经细胞中活性氧的产生、线粒体超极化和脂质过氧化而导致神经系统损伤[12]。此外，谷氨酰胺诱导的兴奋性毒性与许多中枢神经系统疾病的发病有关，包括脑缺血、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、亨廷顿病(Huntington's disease，HD)、癫痫和肌萎缩侧索硬化症等[13]。

1.5 细胞凋亡 细胞凋亡在SCII 的病理生理中起着重要作用。脊髓缺血再灌注后会产生大量的氧自由基，氧自由基具有极强的氧化活性，能与细胞内的多种生物大分子结合，从而破坏细胞结构与功能，造成细胞凋亡[14-15]。

2 锌的生理作用

锌是人体必需的微量矿物质元素之一，也是机体内多种酶、转录蛋白及其他蛋白的重要组成部分，在多种代谢和信号传导途径中发挥着重要作用[16]。锌对许多细胞的生理过程至关重要[17]，在基因的稳定和表达，包括染色体构成、DNA 复制、RNA 转录等方面都起着重要的作用。除此之外，从伤口愈合到神经和生殖功能，几乎所有的代谢过程，锌都发挥着重要作用。锌是各种生命活动所必需的，它的缺乏会导致生长迟缓、细胞凋亡和神经元变性[18]。

锌保护生物结构免受自由基的破坏，可能是由于以下几个因素：含足够的金属硫蛋白(metallothioneins，MTS)，是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的基本成分，也是硫醇(thiols，RSH)的保护剂，从而阻止化学基团与铁之间的相互作用[19]。

3 锌通过抗脂质过氧化减轻SCII

生理剂量的锌通过抗氧化应激对生物体起到保护作用。大量的临床和实验研究表明，人体中锌的缺乏与氧化应激标志物、DNA损伤和炎性细胞因子水平的升高密切相关，而补充锌可以逆转这些不良反应。另有大量研究表明，锌可以通过抑制脂质过氧化反应来减轻自由基对人体的伤害[16]，作为一种抗氧化剂，主要通过三种机制来发挥作用：(1)保护含有游离巯基的蛋白质；(2)竞争氧化还原活性金属；(3)诱导特定的抗氧化反应系统[20-21]。

Mazani等[3]的研究表明，补锌可降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，提高抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)，提高谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)和超氧物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。MDA是血清脂质过氧化产物，而GSH和SOD在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。这意味着补充锌改善了患者的抗氧化状态，降低了脂质过氧化，提高了SOD的活性，而SOD活性的升高会改善机体抗氧化能力和抗氧化状态。综上，锌可以通过改善抗氧化状态，降低氧化应激和脂质过氧化来保护SCII。

4 锌通过抑制细胞凋亡减轻SCII

细胞凋亡是指细胞在发育过程中或在某些因素的作用下，通过细胞内基因及其产物调控而发生的一种程序性细胞死亡，与细胞坏死不同，它是一个主动过程[22]。从宏观角度来看，细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化→进入连续反应过程。而从微观的细胞内部看，细胞凋亡最显著的特征之一是细胞核的浓缩和分裂成更小的片段[23]。凋亡是SCII后导致神经细胞死亡的主要机制之一，Sun等[24]研究发现，SCII发生后内源性和外源性凋亡途径中的主要凋亡效应分子半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)的表达显著增加、促凋亡基因Bcl-2相关蛋白X(BCL2-Associated X，Bax)上调，而抗凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)下调。

Kalkan等[25]研究发现锌通过降低细胞凋亡和保留完整的神经细胞数量来保护SCII。其具体作用机制为：锌预处理可从分子水平阻止MDA的形成，提高GSH活性，降低黄嘌呤氧化酶活性，从而发挥保护作用。

Lin等[26]使用免疫荧光定位法检测NeuN阳性细胞中caspase-3的表达，与SCII组相比，补锌组大鼠脊髓中caspase-3裂解的比例降低。Western印迹分析caspase-3、Bcl-2和Bax的表达水平。与空白对照组相比，锌治疗组小鼠Caspase-3和Bax的表达水平降低，而Bcl-2的表达水平显著升高。

Li等[27]采用Tunel法和Western blotting法观察锌对SCII后细胞凋亡的影响。采用Basso Mouse Scale(BMS)评分和免疫荧光方法观察神经元凋亡和功能恢复情况。我们发现补锌显著增加了粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的表达。G-CSF是由小胶质细胞/巨噬细胞通过NF-κB信号通路分泌。SCII后G-CSF水平升高，而神经元的凋亡水平却降低了，从而促进了神经功能的恢复。这表明锌对SCII的保护作用是通过G-CSF抑制神经元凋亡来实现的。

5 锌通过抗炎症反应保护SCII

SCII的主要信号转导通路之一是Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)介导的炎症反应途径。TLR4通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)介导的级联反应，来促进炎症细胞因子的基因表达，如白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，从而导致神经元损伤[6]。Wang等[28]研究发现，大鼠发生SCII 1.5～3.0 h和6～12 h后，TNF-α水平显著升高，6 h和36 h后，IL-1β水平显著升高。SCII发生时，氧化应激引起小胶质细胞和星形胶质细胞活化，释放大量促炎介质，导致脊髓缺血后的血脊髓屏障破坏、脊髓水肿和中性粒细胞内流。此外，Gokce等[29]通过检测促炎症细胞因子TNFα和IL-1的水平来评价SCII后的神经炎症反应，发现与对照组比较，SCII组TNFα和IL-1水平升高。

机体需要通过调节炎症反应，来应对多种致病因素(如自由基、细胞因子或细菌和病毒抗原)。其中一个主要的炎症途径是NF-κB信号途径。它可以调控细胞凋亡、黏附、增殖、先天性和适应性免疫反应、炎症过程和细胞应激反应，进而影响TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8等促炎因子表达。

A20是一种具有抗炎作用锌指蛋白，对肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)和toll样受体(toll-like receptor，TLR)启动的NF-κB途径负性调节。此外，补锌还可以通过上调A20与DNA特异性结合，降低IL-1β和TNF-α的基因表达，从而抑制NF-κB的激活，下调炎症细胞因子[30]。此外，缺锌会增加单核-巨噬细胞细胞系中TNF-α、IL-1β和IL-8的水平，而补充锌可抑制单核细胞中TNF-α和IL-1β的释放[31]。

NLRP3炎症小体(NOD-like receptor P3 inflammasomes)作为先天免疫系统的重要组成部分，主要分布于小胶质细胞，最近的研究也证实其在SCII后明显表达和激活[26]。其功能是激活caspase-1，进而导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，诱导炎症反应并导致细胞死亡[32，34]。

Lin 等[34]通过ELISA分析显示，脊髓损伤后第3天，脊髓损伤组NOD样受体P3(NOD-like receptor P3，NLRP3)水平高于假手术组。WB法检测NLRP3炎症相关蛋白NLRP3、IL-1β和Caspase-1的表达。结果显示，与假手术组小鼠相比，脊髓损伤组小鼠的NLRP3、ASC、IL1和Caspase-1的表达水平升高，而锌处理组表达水平降低。免疫印迹检测自噬过程中泛素蛋白表达的变化，结果表明NLRP3可以与泛素结合，说明锌处理可以招募泛素与NLRP3结合，并通过泛素化修饰导致NLRP3的降解。

Li等[35]发现锌治疗促进了SCII后3、5、7、14、21和28d小鼠运动功能的恢复。此外，锌还能修复脊髓神经细胞线粒体的结构，促进神经元恢复。同时，锌还能降低SCII后脊髓组织中活性氧和丙二醛的水平，增加超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶的生成。锌发挥作用的具体机制，究其原因是锌处理可上调核因子红系相关因子2(NF-E2-related factor，Nrf2)/ 血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路水平，下调NLRP3炎症相关蛋白的表达。

6 锌转运蛋白减轻SCII

锌转运蛋白(zinc transporter，ZnT)家族至少包含10个成员，ZnT1-ZnT10。它们将锌从细胞内运输到细胞外或细胞内的细胞器。在已鉴定的ZnT家族成员中，ZnT1位于细胞膜中，充当细胞内锌的外排转运体，对维持细胞锌稳态和脊髓功能恢复具有重要作用。有数据表明，所有检测到的ZNTs在脊髓中均有表达，这意味着ZnTs在调节正常和病理条件下脊髓锌代谢方面具有重要的作用[36]。

ZnT1在中枢神经系统中表达丰富，包括脊髓、大脑皮层、小脑和嗅球。ZnT1是唯一一种主要位于细胞膜上的锌转运蛋白，发挥着向细胞外输出锌的关键作用[37]。锌的缺乏，可能引起脊髓内环境紊乱，不利于损伤脊髓的恢复，ZnT1通过将胞质内的锌排出到细胞外，维持神经细胞的锌稳态，促进神经生长因子的表达，对脊髓功能的恢复具有重要意义。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作为一种重要的神经营养因子，在改善神经元病理状态、促进损伤神经元再生、减少神经元凋亡等方面也发挥着重要作用，ZnT1可以促进内源性BDNF的合成和释放，减轻脊髓继发性损伤，促进脊髓功能的恢复[38]。此外，锌可能参与调节中枢神经系统BDNF及其受体的表达，在SCII的病理生理和治疗过程中都发挥重要作用。

7 展 望

SCII造成的脊髓功能障碍、感觉丧失和运动功能损害给患者的家庭和社会带来了沉重的负担，因此寻找有效治疗SCII的方案变得越来越重要。目前对SCII的治疗包括药物治疗，如激素冲击联合神经营养药物、他汀类药物、米诺环素和中医中药治疗，还包括缺血预处理和低温预处理、高压氧疗法等。锌作为一种人体所必需的微量矿物质元素，通过抗脂质过氧化、抗凋亡和抗炎症反应对SCII起到一定的保护作用，此外锌转运蛋白和锌指蛋白的作用也不容忽视。综上所述，锌有望成为治疗SCII的关键因素，为治疗脊柱外科和体内大动脉介入术并发症提供新思路。