人卵巢组织冷冻及移植技术的研究进展及方向

章婷婷

（苏州市立医院东区，江苏 苏州）

0 引言

卵巢组织的冷冻保存及移植作为保存生育能力的手段已被研究多年。用于为育龄期妇女可能面临的可能导致永久性不育的生育前卵巢急性损伤提供生育力保存。作为癌症治疗后最具毁灭性的后果,放疗和化疗可能导致患者生育力受损或完全丧失,尤其是盆腔放疗和高剂量烷化剂如环磷酰胺,已被证明会导致卵巢萎缩,损害卵巢血管,并减少原始卵泡[1]。因此,在治疗前保存生育力势在必行。卵巢组织保存在育龄妇女人群中较为适用，而对于青春期的女孩，采取对卵巢进行冷冻的方法是体外保存生育力的唯一措施[2]。2004 年 Donnez 等[3]首次报道1 例IV 期霍奇金淋巴瘤患者,患者在进行化疗前进行了卵巢皮质冷冻处理，6 年后将冻融的卵巢组织进行原位移植，妊娠后自然分娩一女婴，婴儿各指标均正常。这项报道证实了对于恶性肿瘤患者，采取卵巢冷冻技术能够有效保存生育功能。之后有更多的研究证实了这一点[4]。同时将卵巢组织冷冻移植技术应用于推迟妇女更年期[5],亦可以提高女性患者的生活质量。

1 卵巢组织的获取

组织收集是通过腹腔镜手术进行的。卵巢组织提取的大小程度取决于卵巢功能衰竭的可能性。在临床条件允许的情况下，最佳的手术治疗方式为完整地将单侧卵巢切除，而剩余一侧的卵巢能够正常地发挥该有的功能，也能为以后的卵巢原位移植提供条件。而对于保留的一侧卵巢来说可能会受到后续治疗的影响，导致其功能受损,甚至丧失生育能力。

另外,进行部分切除也是常用方法,去除一半或2/3的卵巢。用于切除卵巢微小组织(5×5×3mm)的技术并不常用,许多卵泡在冻融过程中由于缺血损伤而丧失[6],因此,必须获得足够大的组织以便储存许多卵泡。获得的卵巢组织在用PBS 洗涤后,将其放入含有IVF 培养基的无菌试管中,并运送至实验室准备冷冻保存[7]。

2 冷冻保存技术

皮质主要由原始卵泡填充,由前颗粒细胞所包围的初级卵母细胞。此外,研究发现在皮质中有很小的百分比卵泡已经开始发育,即初级卵泡。对于卵巢皮质采取直接冷冻的方法会有效地保存大量的原始卵泡，卵母细胞具有较小的体积，且结构较简单，具有较低的代谢率，缺少透明带，有较少的亚细胞器对低温具有敏感性，在冷冻的过程中不容易受到损害，同时也不需要对卵巢进行刺激，或是等到卵子成熟，对患者的放化疗不会产生影响。因为一种细胞类型的最佳冷冻保存技术可能对其他人无效[8]。卵巢皮质细胞之间的细胞大小、密度和膜水力渗透性的差异意味着冷冻保存所需的脱水速率以及理想的冷却速率因细胞类型而异。卵巢组织冷冻保存的焦点是成功的冻结和解冻所有细胞亚型,促进最大数量原始卵泡的存活,因为它们直接代表生育力保存。

研究发现[9],大部分始基卵泡都聚集于距离皮质表面0.75mm 内的组织中,故一般认为,1mm 左右的卵巢组织皮质是最为合适的冷冻保存厚度，能够最有效地保存始基卵泡，也可以通过面积的增加更好地渗透保护剂以达到理想的冷却速度从而尽量减少对原始卵泡的损伤,获得满意的冻存效果。

3 卵巢组织的移植

3.1 卵巢移植的必要性和安全性评估

自体移植前,卵巢功能状态的评估是必需的。卵巢衰竭表现为闭经,高促性腺激素、卵巢激素水平低,AMH 水平低以及超声下观察窦卵泡的减少也能提示卵巢衰竭。另外,有些病人在经历了广泛的原始卵泡储存损失[10],在治疗仍会偶尔出现不规则月经,这并不代表她的卵巢功能衰竭。虽然这些患者表现出显著的激素紊乱,FSH 水平较高,但他们仍然可以在不需要卵巢组织移植的情况下受孕。

考虑病人的康复治疗和复发风险,提高卵巢冷冻的安全性至关重要,盆腔超声是必要的第一步,以确保没有宏观的卵巢病理存在,防止不必要的手术或并发症。移植前,先将一小块冰冻的皮质组织解冻,组织学染色,解冻后观察是否有卵泡的存在,并确保没有任何恶性细胞。常用的检查手段有术前影像学检查、术后的新鲜组织病理分析、冷冻后恶性细胞敏感标记物检测等，联合使用多种方法对于发现恶性肿瘤残余细胞有重要作用，减少了细胞的种植，增加了其移植的安全系数。

文献报道的15 例自体移植的霍奇金淋巴瘤病例中,无患者出现移植后的复发情况，而6 例非霍奇金淋巴瘤进行卵巢移植患者中无复发证据。Sanchez-Serrano 等分析在对乳腺癌患者进行卵巢冷冻保存后进行相关的组织学检验尚未发现有恶性肿瘤再植的情况。尤其对于早期的乳腺癌患者采取卵巢冷冻是一种安全的方法。

3.2 移植部位

3.2.1 原位移植

原位移植就是对于冷冻复苏后的卵巢组织将其移植到盆腔中。原位移植可以出现更多卵泡,异位移植卵泡生长减少,卵母细胞恢复率和受精率降低。卵巢移植的一个关键考虑是维持移植组织的血液供应。缺血损伤是导致卵泡丢失的主要原因,因此,移植物充分灌注所需的时间在移植物存活中起着重要的作用。同位移植能够有效地将自然的组织结构进行保存，同时也能保存一定的生殖功能，越是靠近输卵管进行移植其自然受孕率越高。2015年[11]1 例28 岁葡萄牙女性接受冷冻10 年卵巢组织进行自体原位移植,术后通过卵巢刺激方案获得2 个卵子,并成功获得1 枚胚胎。

3.2.2 异位移植

异位移植指的是冷冻复苏后的卵巢组织移植部位为非盆腔内，其常见的移植部位为腹壁及前壁的皮下。异位移植的优点是移植物便于观察、移植或取出。尤其对于有盆腔粘连或是盆腔血供不具备较好的条件时采取异位移植效果较好。但是无血管移植,可能导致卵巢组织的缺血并加速残存卵泡的闭锁;且不能进行自然妊娠,必须进行促排卵、取卵和体外受精才能获得妊娠。

4 完整卵巢移植

4.1 完整卵巢移植的优势

该移植存在的问题主要是在新生血管生成期由于缺血的原因而导致丢失大量的卵泡,现已有研究尝试使用额外的技术和环境因素作为一种手段,以改善移植血管重建,缩短缺血期,从而提高整体移植物存活率。有研究显示SCID 小鼠卵巢移植显示,当加入抗氧化剂、维生素E,卵泡存活率增加。但带血管蒂的整体卵巢移植则可通过直接对血管进行吻合而减少组织的缺血损伤,从而有望保存更多的卵泡而使卵巢功能得以长久维持。Oktay 等[12]报告了59 例妇女通过卵巢片段移植术后,卵巢功能维持平均为(36.8±3.6)个月。卵巢功能维持时间最长者已超过7 年。

4.2 完整卵巢移植的的技术难点

整体卵巢移植存在的技术难点有:(1)整体卵巢冷冻困难。对于整体卵巢冷冻冷冻剂以及冷冻方式的选择,仍没有标准的冷冻方案。(2)冷冻前对整体卵巢的灌注不可避免地对卵巢组织和微血管带来损伤,以及吻合术后血栓形成也会造成大量卵泡损失,导致其保存卵泡的优势下降。(3)显微外科血管吻合手术技术和手术时间也是影响卵巢移植后卵泡存活率的常见因素,对于外科操作的水平有更高的要求。(4)整体卵巢组织在携带了更多卵泡的同时,携带残留癌细胞的风险加大。

最近关于卵巢组织冷冻和移植成功的怀孕和分娩的报告,为那些由于需要立即开始化疗或放射治疗而失去生育能力的患者提供了巨大的希望。需要更多的研究来优化冷冻保存和组织移植的流程。此外,进一步改进识别微小残留病的方法是必要的,以确保没有恶性细胞转移及复发。整体卵巢移植为更好地保存生育力提供了方法,但同时也有更高的技术要求。能肯定的是,卵巢组织冷冻保存技术在生育力保存具有真实的潜力,为生育力保存提供了切实可行的新思路、新方向[13]。随着科学技术的不断进步,人卵巢冷冻技术将会得到进一步的提高，该技术会克服一些困难得到完善，在以后的应用中会充分发挥出应有的作用。