纳米银颗粒用于牙周和种植体周抗菌的研究进展

梁 晔，邵金龙，葛少华

牙周炎(periodontitis)和种植体周围炎(peri-implantitis)是发生于牙或种植体周围支持组织的炎症性疾病，其始动因素为菌斑微生物，可引起牙槽骨吸收，甚至牙齿缺失及种植体松动脱落。牙周炎被认为是口腔中发病率位居第二的疾病，仅次于龋齿[1]。第四次全国口腔健康流行病学调查显示，35～44岁、55～64岁和65～74岁年龄组牙周健康率分别仅为9.1%、5.0%和9.3%，意味着绝大多数中老年人牙周组织处于炎症状态[2]。近些年，随着种植手术惠及越来越多的患者，种植体周围炎成为影响种植预后的重要因素，其发病率可达9%左右[3-4]。目前提倡的以菌斑控制为导向的牙周治疗(guided biofilm therapy，GBT)强调良好的菌斑控制是治疗成功的关键。无论是牙周炎还是种植体周围炎，临床上常采取牙周基础治疗、牙周手术治疗辅以药物治疗(多为抗生素类药物)等手段以更好的清除牙周致病菌。但抗生素易诱导产生耐药菌株[5]，且抗生素难以有效杀灭菌斑生物膜中的细菌[6]。近些年，纳米银颗粒(silver nanoparticles, AgNPs)因其抗菌谱广，抗菌性能强且可抑制菌斑生物膜[7]，不易诱导产生耐药菌株而获得广泛关注[8]。此外，AgNPs还可与抗生素发挥协同抗菌作用[8-9]，因其性质稳定从而可发挥长效抗菌作用[10]。因此，AgNPs在牙周治疗中具有潜在的应用优势。

1 纳米银颗粒的抗菌机制及其影响因素

1.1 纳米银颗粒的抗菌机制

AgNPs可作为纳米颗粒进入细菌，在胞内继续溶解释放大量银离子(silver ion, Ag+)发挥作用，被称为“特洛伊木马”效应[11-12]，这是其发挥广谱、高效抗菌作用的主要机制之一。AgNPs可通过静电作用吸附于细菌表面[13-14]，中和细菌表面电荷，同时会造成细胞壁、细胞膜结构紊乱，破坏细胞膜成分，使细胞膜通透性增大[15-16]，甚至导致细胞膜表面产生孔隙，细菌内容物外漏，造成细菌死亡[14-15]。AgNPs吸附于细菌表面后，粒径较小者可进入细菌胞内，与细胞结构及生物信号分子(如脂质、蛋白质)结合，同时可以使核糖体、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)发生变性，影响细菌转录、翻译、蛋白质合成等功能[13,17]。另一方面，AgNPs在溶解氧存在的条件下通过氧化溶解释放Ag+[18]，Ag+可与巯基结合，干扰二硫键的形成，影响呼吸链脱氢酶等多种蛋白质、生物信号分子功能，影响细菌生存[13,15,19]。Ag+还可与DNA中的核苷酸形成复合体，破坏碱基对之间的氢键，影响细菌分裂与增殖[13,20]。

AgNPs导致胞内活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)水平升高是其发挥抗菌作用的主要机制之一。一方面Ag+与呼吸链蛋白结合，阻断胞内超氧化物还原，造成ROS产生增多；另一方面会影响硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)系统的功能，干扰ROS的清除，导致胞内氧化应激水平升高，影响细菌正常功能[13,15]。Trx系统是细菌氧化还原系统重要组成部分，包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)、Trx、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TrxR)，可通过其二硫键还原酶活性来发挥抗氧化作用改善氧化应激状态[21]。Chen等[22]发现AgNPs能有效抑制大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)的TrxR活性，从而影响TrxR对Trx的还原过程，进一步抑制Trx向下游蛋白的电子传递，影响甲硫氨酸硫氧化物还原酶(methionine sulfoxide reductase，MSR)，保护E.coli免受活性氮介质损害的功能以及过氧化酶细菌铁蛋白共迁移蛋白(bacterioferritin comigratory protein，BCP)和巯基过氧化酶(thiol peroxidase，Tpx)清除ROS的功能，从而导致ROS积聚[21]。此外，Trx可向DNA合成的关键酶核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RNR)传递电子，AgNPs可能通过阻断此途径影响DNA的合成[23]。

AgNPs作用于细菌可引起多种膜蛋白的调控，可能会影响离子结合、转运等功能，造成细菌内电解质的失衡，是其抗菌的另一重要分子机制[24]。Yan等[24]发现AgNPs作用于铜绿假单胞菌后，许多离子转运蛋白表达受到抑制，包括铜离子、铁离子、镁离子、锌离子的转运蛋白，这可能有助于AgNPs及Ag+通过跨膜通道进入胞内。Lee等[25]也发现AgNPs可引起E.coli胞内钙离子水平升高，磷脂酰丝氨酸外翻，细菌出现凋亡样反应。此外，革兰阴性(gram negative, G-)菌细胞壁所存在的外排泵是耐药菌产生的主要结构基础，其可将抗生素排除胞内[26]，AcrAB-TolC外排泵为其中之一，Mishra等[27]发现AgNPs可降低该外排泵结构成分中内膜蛋白(AcrB)的表达来抑制其功能，这可能是AgNPs不易诱导耐药菌株产生及可增强一些抗生素对耐药菌株抗菌作用的原因。

1.2 纳米银颗粒的抗生物膜作用

生物膜为附着于物体表面的细菌群体，其相较于浮游微生物，对抗生素的抵抗力更强，也是许多慢性感染性疾病迁延不愈的重要原因[28]。口腔内细菌易形成菌斑生物膜并进一步加速细菌聚集[29]，导致牙周炎易复发。而AgNPs具有抗生物膜作用[7, 30]，Halkai等[7]在处理过的牙本质块上建立了粪肠球菌、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)的2周生物膜模型，发现在对应浮游细菌的最低抑菌浓度(20～30 μg/mL)下，AgNPs也可对生物膜中细菌发挥有效抗菌作用。这是AgNPs相较于多数抗菌药物的优势之一。

生物膜的形成始于浮游细菌的定植，然后粘附于基质表面的细菌增殖并分泌细胞外基质促进更多细菌识别、粘附直至菌斑生物膜形成成熟、复杂的结构[31]。链球菌是菌斑生物膜形成过程中最先定植的细菌，而硫辛酸修饰的AgNPs可分别以20、40 μg/mL的浓度去除表皮葡萄球菌和变异链球菌1 d形成的生物膜，且该浓度对人牙龈成纤维细胞无毒性[30]。胞外多糖为生物膜的重要基质成分，是生物膜形成的先决条件，Kalishwaralal等[32]发现AgNPs可减少铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌胞外多糖的产生，这将减少细菌的粘附和共聚。此外，通过对铜绿假单胞菌生物膜结晶紫染色分析发现，AgNPs随浓度增加可延迟生物膜形成时间，且生物膜中最大生物量也随之降低，而当浓度达到18 μg/mL，生物膜的形成受到明显抑制，直至20 h尚未形成生物膜，该研究还对成熟期生物膜结构通过激光共聚焦显微镜及扫描电镜进行观察，也证实生物膜中最大生物量、基质覆盖率随AgNPs浓度增加而降低，生物膜破坏产生的离散菌落也使其粗糙度随AgNPs浓度增加而增大[33]。关于AgNPs抗生物膜作用的具体分子机制尚需进一步研究。

1.3 纳米银颗粒抗菌性能的影响因素

AgNPs的抗菌作用与浓度、分散稳定性、粒径和表面电荷等因素有关[7,15,34-35]。大量研究表明，AgNPs的抗菌和抗生物膜作用均具有浓度依赖性[15,30,36]。El-Wassefy等[37]研究了添加AgNPs的玻璃离子对变异链球菌的抗菌效果及抗生物膜作用，发现AgNPs为25 μg/mL时，变异链球菌生物膜相比对照组减少了60.1%，而在50 μg/mL浓度下可减少83.4%。AgNPs分散稳定性越好，比表面积越大，则抗菌作用越强[15,38]。表面活性剂可以增加AgNPs的分散稳定性[15]，通过添加壳聚糖制备的AgNPs便具有良好的分散度和稳定性，对E.coli显示出良好的抗菌性能[39-40]。Kvítek等[15]通过研究不同表面活性剂修饰的AgNPs的抗菌性能，发现效果最佳者为分散度最好的十二烷基硫酸钠修饰的AgNPs。对于不同粒径的AgNPs(5～100 nm)，其抗菌作用随粒径减小而增强，在AgNPs粒径小于10 nm时，抗菌作用迅速增强[15,35]。另一研究发现1～100 nm的AgNPs对G-菌的作用也有类似效果，仅直径为1～10 nm的AgNPs吸附于细菌表面后可进入胞内发挥“特洛伊木马”效应[41]。因此，粒径大小对抗菌作用有着直接影响[15,41]。大多数细菌表面带有负电荷，这与革兰阳性(gram positive, G+)菌表面肽聚糖及G-菌表面脂多糖中的磷酸基团、羟基基团有关[42]。经过有机修饰的AgNPs的抗菌性能与其表面电荷亦有关系，与E.coli电荷差异大的支化聚乙烯亚胺修饰的AgNPs抗菌作用较强，电荷差异越大，吸引力越大，则越利于AgNPs吸附于细菌表面，抗菌性能越强[36]。因此，AgNPs的抗菌性能与表面电荷密切相关[16,30]。zeta电位测试证实，3种常见龈下牙周致病菌——Pg、中间普氏菌(Prevotellaintermedia，Pi)、伴放线聚集杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa)在生理pH下表面均带有净负电荷[43]。有研究显示经不同修饰的AgNPs表面电荷分布在-38～40 mV，因此可通过改变表面电荷的方式增强其抗菌作用[44]。表面带正电荷的AgNPs理论上对牙周致病菌具有更好的抗菌作用。

口腔中菌群复杂，牙周致病菌种类繁多，并且口腔细菌极易形成菌斑生物膜而不利于抗生素的作用，而AgNPs具有较强的广谱抗菌性能及抗生物膜作用[13,15]，对牙周疾病的抗菌治疗具有优势，但口腔环境复杂，如何应用AgNPs使其维持稳定，同时避免对口腔正常菌群、正常组织产生不良影响的问题尚需进一步探究。

2 纳米银颗粒的细胞毒性

2.1 纳米银颗粒细胞毒性的机制及影响因素

近年来，AgNPs因其优越的抗菌性能在医学领域有着重要的应用前景，但AgNPs具有一定的细胞毒性，且不慎泄露会造成环境污染。AgNPs的细胞毒性、基因毒性主要与胞内ROS水平升高有关[17]，其机制与抗菌机制类似，一方面AgNPs在氧存在的条件下会产生ROS，另一方面AgNPs和所释放的Ag+会影响氧化还原系统功能[45]。Harvanova等[46]通过拉曼成像证实AgNPs在成纤维细胞内呈聚集状态，这可能是由于单个小颗粒不足以激活细胞膜上的受体，AgNPs聚集成较大的团聚体得以进入细胞，由此推测AgNPs所引起的DNA损伤主要是由胞内ROS升高导致。AgNPs对不同细胞的细胞毒性也有所差异。小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)和直肠癌上皮细胞(HCT116)对AgNPs的反应不同，NIH3T3胞内ROS水平升高且会激活线粒体凋亡途径，而HCT116会激活抗凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，bcl-2)来保护细胞[47]。

与抗菌性能影响因素类似，AgNPs的毒性与粒径、表面特性、浓度等密切相关[35,48-49]。Hernández-Sierra等[50]用不同粒径的AgNPs研究其对牙周膜成纤维细胞的细胞毒性，结果表明80～100 nm的AgNPs对细胞无明显影响，但粒径小于20 nm的AgNPs呈现明显浓度依赖性的细胞毒性。真核细胞对AgNPs的耐受强于原核细胞，真核细胞可通过过表达翻译、氨基酸生物合成等相关基因来减轻AgNPs的损害[51-52]。因此，细胞毒性浓度和抗菌浓度的差异可作为其抗菌应用的治疗窗口。综合分析多个动物实验发现比表面积30 m2/g的AgNPs的安全阈值浓度为12 μg/mL[53]。值得注意的是，在安全浓度范围内，AgNPs虽不会导致细胞凋亡，但可能会影响胞内生物进程，扰乱细胞器功能等[54]，因此，尚需关注亚致死浓度AgNPs对细胞的影响以进一步确认临床应用安全浓度范围。

2.2 降低纳米银颗粒细胞毒性的措施

AgNPs的细胞毒性大小与颗粒物理特性[55]、表面化学特性[56]等因素有关。目前通过改良AgNPs各种特性降低其细胞毒性的方法主要有：生物合成法、结合生物分子、应用抗氧化剂、改变应用方式等。许多研究利用生物合成(比如植物提取物、真菌等)方法制备AgNPs，虽其保留有较好的抗菌性能以及抗氧化性，但仍有一定的细胞毒性[57-58]。研究发现，与一些生物分子结合也会对其细胞毒性有所改善，蚕丝蛋白具有还原性及促进骨再生的作用，与蚕丝蛋白结合的AgNPs不仅具有较好的生物相容性、抗菌性，还可促进细胞成骨分化[59]。另外，AgNPs与壳聚糖结合，对生物相容性亦有所改善[40]。AgNPs细胞毒性与ROS产生过多引起氧化应激密切相关，因此很多研究通过应用抗氧化剂，降低其细胞毒性[22,60]。Ferreira等[60]选用几种巯基抗氧化剂和非巯基抗氧化剂研究其对化学合成、生物合成AgNPs细胞毒性的影响，结果显示所有抗氧化剂均可降低胞内ROS水平，但只有巯基抗氧化剂可与AgNPs结合导致其聚集而降低细胞毒性。AgNPs应用形式的改变也可能降低其细胞毒性，研究表明，AgNPs的直接作用可能会导致细胞膜破裂，因此，Jiang等[61]研究设计了一种含AgNPs的水凝胶，既实现AgNPs不与细胞直接接触，又可达到缓慢释放Ag+的目的，该材料在伤口愈合中表现出较好的抗菌性能、细胞相容性，并且使局部处于低水平的炎症平衡状态，降低伤口愈合慢性长期化的风险。AgNPs种类繁多，细胞毒性机制复杂，因此，尚需进一步深入研究探讨降低AgNPs细胞毒性的方法及其相关机制来促进AgNPs的生物医学应用。

3 纳米银颗粒在牙周炎治疗中的应用

3.1 纳米银颗粒对牙周致病菌的抗菌作用

临床上牙周炎的治疗主要为机械去除牙石、牙菌斑，但对于深牙周袋，菌斑去除的有效性难以保证。Aa、Pg等牙周致病菌的残留会导致牙周组织的继续破坏以及致病菌的繁殖和再聚集[62]。牙周致病菌以G-菌为主，Feng等[63]发现AgNPs更易吸附于E.coli(G-菌)表面并进入胞内，对G-菌的敏感性高于G+菌，而学者的研究表明3种不同表面修饰的AgNPs均能有效抑制口腔内绝大多数厌氧菌，但对G+菌效果优于G-菌[30]。2种结果差异可能是由于AgNPs的修饰不同以及G-多重耐药菌通常含有Trx系统和谷胱甘肽(glutathione，GSH)抗氧化系统，其中，GSH作为细菌体内含量最丰富的含巯基小分子肽，在保护蛋白免受氧化损伤及清除ROS中发挥着重要作用，而大部分G+菌只有Trx系统，缺乏GSH，这可能是AgNPs对G+菌抗菌效果更佳的原因。[64]研究表明AgNPs对牙周致病菌(如Pg)具有较好的抗菌效果，并且作用不亚于目前临床上常用的氯己定[65]。此外，Harvanova等[46]通过拉曼成像证实平均粒径分别为30.6 nm和20.4 nm的AgNPs可进入成纤维细胞，可能会对细胞内的Pg发挥抗菌作用，但AgNPs对胞内Pg的抗菌效果及相关机制尚需进一步的深入研究为AgNPs应用于牙周治疗中辅助抗菌提供依据。

3.2 纳米银颗粒在牙周炎治疗中的应用方式

AgNPs在牙周炎治疗中的应用方式主要包括牙周手术术后感染预防和患者口腔卫生维护。

AgNPs作为牙周手术术后感染预防的应用方式主要有添加至胶原膜[66]、牙周塞治剂[67]中。AgNPs可通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路下游激活减少脂多糖所诱导的炎症因子分泌[68]，这为其用于牙周炎的抗炎治疗提供可能。另外，AgNPs可通过Ras同系物基因家族成员A-Tafazzin(RhoA-TAZ)通路来促进牙周膜成纤维细胞成骨分化[69]，为其作为辅助材料应用于牙周手术提供了依据。负载AgNPs的胶原膜除表现出卓越的抗菌、抗炎性能外，细胞毒性有限，同时还有诱导间充质干细胞成骨分化的能力，因此在预防牙槽嵴重建骨移植术后感染中有着良好的应用前景[66]。而应用添加AgNPs的牙周塞治剂后，创口处炎症细胞较少且新生胶原及血管化较明显，同时具有较好的生物相容性，因此其可作为局部药物递送或加入牙周塞治剂、引导组织再生膜中，实现其在牙周疾病治疗中的安全应用[67]。

作为患者口腔卫生维护的应用方式主要有添加AgNPs的牙刷[70]、牙膏[71]、漱口水[72]、抗菌凝胶[73]、喷剂[74]等，均表现出较好的抗菌效果。另有研究发现含AgNPs牙刷短期抗菌性能在菌斑指数、牙龈出血等指标较普通牙刷更有优势[59]。且含AgNPs牙刷24 h银释放量极少，对人体和环境暴露产生的影响几乎可以忽略[75]。添加AgNPs的牙膏、牙刷、漱口水等已经商品化进入我们的日常生活，相关研究也已经证实其具有良好的抗菌效果，为其合理应用提供了科学依据[70,75-76]。但需要注意的是，并非所有添加AgNPs的产品都是安全的，如喷剂可能会造成吸入暴露，导致AgNPs沉积于呼吸道[74]。上述产品虽已申请专利或实现产品化，但目前还未实现广泛应用，可能是因为AgNPs种类繁多且具有一定细胞毒性，其安全标准尚无定论。因此，尚需进一步研究明确其对口腔相关细胞的细胞毒性及机制，探讨AgNPs对口腔相关细胞、人体的安全性以及降低其毒性的方法。

4 纳米银颗粒在种植体周围炎中的应用

4.1 纳米银颗粒用于植体表面处理的修饰方法

目前关于AgNPs在种植体周围炎中的研究主要集中在用AgNPs对种植体进行表面修饰，从而达到预防种植体周围炎的目的。近些年，为实现种植体更好的骨结合，钛种植体表面多进行喷砂、酸蚀等表面处理，这虽然有利于细胞聚集、吸附获得更好的骨整合，但也可能会加剧细菌的聚集，从而增加种植体周围炎的风险[77]。为此，很多研究将AgNPs加入(植体)表面处理以增强种植体的抗菌性，其主要修饰方法有等离子体浸没离子渗入法(plasma immersion ion implantation，PIII)[78]、磁控溅射法[79-80]、电化学沉积法[34]和等离子体电解氧化法(plasma electrolytic oxidation，PEO)[81]等。其中，PIII法可控制AgNPs的分布和浓度，实现Ag+的微量释放,可能由于表面拓扑结构的改变，其生物相容性优于无AgNPs修饰者，体外及体内实验均表明其在预防种植体周围炎中具有应用价值[13]。磁控溅射法可在植体表面形成厚度均一的涂层，且结合力较强[13]，Uhm等[79]用该方法修饰的植体除具备抗菌性能且无明显细胞毒性的特点外，接触角相较于未修饰者小，利于细胞的吸附。电化学沉积法是一种简单且经济效益较高的修饰方法，并且在Ti6Al4V植体表面通过电化学沉积法加入不同粒径(5 nm和30 nm)的AgNPs后，对Pg、Pi均有较好的抗菌作用，虽然会出现一过性的细胞毒性，但不影响细胞在材料表面的粘附和铺展[34]。PEO法可以将AgNPs固定在钛种植体表面的氧化层内形成多孔结构，从而避免AgNPs随意进入血液循环，并可持续释放Ag+达28 d[81]。这些修饰方法均可赋予种植体抗菌性能，区别在于AgNPs与植体结合力不同、对植体表面结构有不同改变等，可根据不同需求选择合适的修饰方法，但关于不同修饰方法的Ag+释放规律、AgNPs用量的精确控制和对周围组织细胞的影响还需更多研究来进一步明确。

4.2 纳米银颗粒用于植体修饰的利与弊

大量研究表明AgNPs修饰无明显细胞毒性[78,82-83]，但也有实验表明植体表面的AgNPs抑制了成骨细胞的增殖[84]，AgNPs对间充质干细胞的毒性也与成骨、破骨细胞类似，呈浓度依赖性增加[13]，AgNPs修饰会在48 h内呈浓度依赖性降低细胞增殖率，但在72 h便已恢复[34]。AgNPs在亚毒性浓度范围内会促进间充质干细胞增殖，而在浓度高于10 μg/mL时会抑制细胞增殖[85]。也有研究发现AgNPs还可在20 μg/mL的浓度下促进小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)矿化[86]。实现AgNPs的精准控释既可有效发挥抗菌作用，又能同时减轻损害。因此，AgNPs释放浓度的精确控制是其生物医学应用的关键。选择合适修饰方法有利于控制AgNPs的释放。种植体表面的AgNPs存在脱落进入血液循环的风险，如原位合成法形成的AgNPs结合力较弱[13]，而选择结合力强的修饰方法可避免这种全身损害[81]。在发生细菌感染时，局部的pH会降低，Dong等[82]通过乙缩醛作为连接，将AgNPs连接到钛纳米管阵列种植体上，该植体上的AgNPs在环境pH低时释放增多，可以更精确的发挥抗菌作用，同时该材料对成骨细胞无损害且具有骨诱导性能，具有很好的应用前景。由于影响AgNPs毒性的因素较复杂，不同研究中的安全浓度均需单独进行探索。虽然目前关于植体表面AgNPs修饰的研究已有较多，但多为短期研究，还需长期研究来探究AgNPs的有效作用时间以及作用失效后的解决方案。此外，AgNPs对骨结合的影响也需要更多体内实验来进行深入探索。

5 小 结

AgNPs抗菌机制与细菌的多种结构和代谢途径有关，抗菌谱广。其抗菌效果呈浓度依赖性，在较低浓度具有良好的抗菌性，但其在高剂量应用时有可能会产生细胞毒性。如何控制细胞毒性是其进行临床转化的最大阻碍。虽然目前通过改良AgNPs的物理、化学特性以减轻其细胞毒性已取得一定的成效，但仍需进一步研究以精准控制应用过程中AgNPs及其释放的Ag+浓度。在牙周领域，AgNPs对牙周致病菌有良好的抗菌作用，其在牙周炎及种植体周围炎治疗或预防中具有独特的优势，有望通过与牙周手术材料、种植体结合或以药物递送的形式来发挥作用。但如何平衡AgNPs的抗菌性能与细胞毒性仍是其进入临床牙周治疗前需解决的难题。因此，尚需更多研究为其在牙周疾病治疗中更好地发挥作用提供依据。