外泌体在口腔组织修复与再生中的研究进展

张 璐，王凯欣，王晓春

外泌体是直径为40～100 nm，密度为1.10～1.18 g/mL的双层脂质结构的小囊泡[1]，起初它被认为是细胞代谢的副产物[2]，但近年的研究发现，外泌体在细胞通信方面发挥作用，是细胞旁分泌的介质，具有重要的细胞间调节功能。在最近的临床干细胞实验研究中，有结论表明，不仅干细胞利用率低下，且有一部分干细胞注射会引起严重并发症，例如肿瘤[3]。这让我们不得不考虑干细胞疗法的生物安全性。然而，随着无细胞疗法的出现，应用外泌体作为组织再生的工具出现了，其优点在于：它克服了传统干细胞疗法的局限性和风险性，并可设定明显的靶向性，为组织修复与再生开辟了新视角。口腔颌面部损伤可导致复杂的软、硬组织缺损，包括皮肤、血管、神经、骨、牙齿等，严重影响患者的生活质量，外泌体作为无细胞疗法促进组织再生的潜在解决方案，在一定程度上可以实现口腔颌面部组织的修复和再生。此外，外泌体不仅可以应用于修复、再生组织，它在抑制炎症反应、调节机体免疫、作为癌症的诊断标志物以及药物载体等方面也有广泛应用[4]。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的来源及生物学性状

细胞可以分泌多种细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，根据生物发生、大小、密度和主要蛋白标记物可分为：微囊泡、凋亡小体、外泌体等[5]。外泌体作为胞外囊泡的一种，能被内皮细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)等各种细胞分泌与摄取，且不同来源的外泌体在形态、内容物和功能方面都具有特异性[6]。外泌体的形成与释放过程不同于其他微囊泡的出芽方式，其形成过程为：细胞膜首先向内出芽形成多囊泡内体(multivesicular body，MVB)，MVB内陷形成双层脂质层结构的内囊泡，即为外泌体，当MVB与细胞膜融合时，外泌体以胞吐的形式被释放到细胞外[7]。外泌体在细胞外环境中可以通过三种途径与受体细胞相互作用：通过内吞摄取或通过囊泡与细胞膜的直接融合进入细胞，也可能通过配体受体介导，以粘附到细胞表面来传递其内含物。外泌体内含有母细胞的特定物质：RNA、游离脂肪酸、蛋白质、表面受体以及细胞因子等[5]，使其可以作为介入靶点，在组织修复再生[8]、免疫调节[9]、癌症发展[10]、临床疾病诊断[11]等过程中发挥重要作用。外泌体所含有的的蛋白包括四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)、热休克蛋白、脂蛋白等，还有一些转运相关蛋白，能将外泌体定位于特定的靶细胞，参与机体多种生物学过程[12]。

目前，基于外泌体的大小、密度、免疫亲和力等，广泛应用的外泌体提取技术有：超速离心、密度梯度离心、大小排阻色谱、微流体分离法、免疫吸附法等[13-14]。超速离心法是当前被广泛应用的提取金标准，但它也有缺点，例如耗时长、需要大量样品、获得率低且存在其他颗粒污染[15]。与常规提取方法相比，基于微流体系统的外泌体分离技术可以快速、便携且精确地处理纳米颗粒或少量液体样品[16]。

1.2 外泌体的功能

外泌体作为一种局部和全身的细胞间通信介质，可以通过直接转导或间接水平转移大量RNA，蛋白质和miRNA等，这些分子被递送至邻近和远处的细胞[17]，可以改变受体细胞的功能，从而调节周围的微环境，在免疫系统和肿瘤发生中起重要作用。外泌体包含用于在免疫细胞之间或在免疫细胞与靶细胞之间传递信息的几种分子，可以作为免疫调节剂，发挥免疫抑制或免疫激活作用[18]。其中，抑制性外泌体可能影响促炎和抗炎效应T细胞之间的平衡，有用于治疗移植排斥或自身免疫疾病的潜能[19]。除了免疫细胞外，肿瘤细胞也可以分泌具有免疫活性的外泌体，对免疫系统产生一系列的有害影响，诱导活化的细胞毒性T细胞凋亡、单核细胞向树突状细胞分化受损等[20]。肿瘤外泌体还可以与正常间质细胞进行通信，建立良好的肿瘤微环境，从而影响原发性肿瘤的生长及侵袭、转移微环境的形成、血管生成以及免疫抑制，还能加强对化学疗法的抵抗力[21]。外泌体虽能促进本体的癌症进展，但它的特异性和可控性也使其成为检测、控制和治疗癌症的新靶点[22]。外泌体中的特定组分对早期检测各种癌症有重要价值，例如，外泌体miRNA对肺腺癌的筛查[23]、卵巢癌的诊断[24]等有重要帮助，还可以作为区分低度恶性和高度恶性膀胱癌[25]、乳腺癌[26]的新型候选生物标志物，也可以作为检测口腔鳞状细胞癌转移的潜在生物标记物[27]。另外，外泌体作为天然纳米囊泡的优势，可根据相关疾病进行修饰，作为生物活性载体产生细胞毒作用用于癌症治疗[28]，发挥神经保护作用用于神经退行性疾病的治疗[29]，提高疾病治疗的效果。外泌体的使用相对于细胞介导的药物输送系统，具有低免疫原性、低毒性、强循环滞留性，避免了人工合成载体的快速清除和细胞毒性的弊端，为将各种治疗药物传输至靶细胞提供了新型方法。

另外，外泌体作为一种新的递送系统，还广泛应用于再生医学中的无细胞疗法。在用于组织再生的传统细胞疗法中，干细胞的组织修复与再生功能的实现，不仅是在损伤部位的自身增殖和分化，可能主要是由旁分泌释放的外泌体实现的[30]，外泌体充当局部递送系统，继而影响邻近和远端细胞实现组织修复与再生。目前研究表明外泌体能够在骨、皮肤、血管、周围神经和牙齿相关组织等的再生中发挥作用。例如：MSC衍生的外泌体能够诱导上皮细胞增殖以及血管生成，促进成纤维细胞激活胶原蛋白和弹性蛋白分泌，来诱导皮肤伤口的上皮再形成[31]；MSC外泌体还可以促进肌肉再生[32]；并在神经元损伤[33]和脑外伤模型[34]中修复和再生神经细胞，表现出强大的神经保护能力。

2 外泌体在口腔颌面部组织修复与再生中的应用

2.1 组织创伤的修复

口腔颌面部的软硬组织损伤对于患者面部的形态及功能影响极大，快速且尽可能小瘢痕的软组织修复和功能性骨组织的再生将是未来临床治疗的最终目标。Cooper等[35]发现脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)分泌的包含LncRNA(MALAT1)的外泌体能够促进创口处人皮肤成纤维细胞的迁移和血管生成，而无需干细胞的参与，表明了使用含MALAT1的hADSCs产生的外泌体治疗颌面部缺血性伤口的可能性。另外，外泌体可以加速创口愈合，使瘢痕组织形成最小化。Zhao等[36]的研究发现，人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)的外泌体可以促进成纤维细胞的迁移和增殖，高浓度的外泌体(100 μg/mL)可能通过刺激基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)的表达部分消除细胞外基质的沉积以减少瘢痕形成，这说明，hAECs的外泌体可以作为无细胞疗法用于颌面部无瘢痕伤口愈合的新希望。Wei等[37]用骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)刺激巨噬细胞，其衍生的外泌体在体外有利于成骨细胞的分化，将该外泌体用于修饰钛纳米管植入物可以避免异位骨的形成并减少不良影响，这证明了外泌体整合的钛纳米管可作为新兴的颌面部骨组织再生的功能材料。另外，源自人牙周膜干细胞(human periodontal-ligament stem cells，hPDLSCs)[38]和人类牙龈间充质干细胞(human gingival mesenchymal stem cells，hGMSCs)[39]的外泌体在颅骨缺损模型中，具有良好的生物相容性和成骨性能，能够有效促进骨愈合，成为颅骨损伤后重建的新策略。

2.2 周围神经组织再生

肿瘤或创伤可能导致口腔颌面部周围神经的损伤，导致部分或完全感觉和运动神经功能障碍，使患者生活质量下降。然而，使用自体神经移植需要牺牲功能正常的神经，且移植干细胞可能会引起严重并发症。近年来，随着外泌体的研究进展，有研究发现外泌体对周围神经损伤后轴突再生具有促进作用[40]。已有研究证实了来自MSC、施万细胞(Schwann cells，SCs)等的外泌体在周围神经组织修复与再生中发挥重要调节作用。魏俊吉等[41]通过谷氨酸诱导体外神经损伤，研究外泌体的神经保护作用及可能的信号途径，发现外泌体可能通过激活PI3K-Akt信号途径介导，调节神经细胞存活，发挥保护作用。另有研究表明，当神经损伤后，SCs脱分化为祖细胞样状态，其外泌体可以参与SCs与轴突间的相互作用，显著促进轴突再生，有效地引导轴突到达其原靶组织[42]。Wang等[43]的研究表明，SCs来源的外泌体可能参与了骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向SCs的分化。以上研究为外泌体促进周围神经再生提供了理论依据，外泌体可能是实现颌面部神经损伤后修复和再生的新靶点。

2.3 血管再生

外伤或肿瘤术后的血运重建对于颌面部软硬组织再生至关重要，丰富的血运形成给组织提供营养物质的同时，可以加速骨质改建、神经再生甚至牙髓再生，并维持新组织的活力。Zhang等[44]证明了人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs)外泌体可以促进内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，在大鼠皮肤烧伤模型的体内实验中，外泌体促进了伤口愈合和血管生成，由此推测这可能是皮肤伤口愈合的重要机制。Hu等[45]将外泌体皮下注射于小鼠全层皮肤创面发现：外泌体的局部移植促进了皮肤再上皮化，减少了瘢痕宽度，促进了血管生成；在体外外泌体可促进成纤维细胞的增殖和迁移，增强内皮细胞的血管生成活性。最终得到结论：外泌体是重要的血浆活性调控因子，可作为一种新的软组织创面愈合策略，为将来外泌体应用于口腔颌面部创伤后的血运重建提供了新思路。更多的研究将口腔组织的干细胞在缺氧等应激诱导条件下培养，或用促血管生成基因转染，从而导致促血管生成外泌体的分泌，这使外泌体成为口腔组织再生中刺激性血管生成的新选择[46]。

2.4 牙周组织再生

牙周炎所造成的牙周附着组织丧失和牙槽骨吸收即使去除炎症也难以恢复，改善牙周附着水平和争取组织的再生成为临床牙周治疗的更高追求。Chew等[47]在免疫活性大鼠模型中手术造成牙周组织缺损，然后使用含有人MSC外泌体的胶原海绵进行治疗，发现这种胶原海绵可以促进牙槽骨和牙周韧带的再生，更有效地修复缺损。这个发现首次证明，MSC外泌体可能通过增加牙周韧带细胞迁移和增殖来促进牙周再生，是一种可行的即用型无细胞疗法，用于治疗牙周缺损，且没有任何不良影响。Mohammed等[48]研究发现，脂肪间充质干细胞的外泌体能够作为非手术牙周治疗的辅助工具，促进牙周纤维、血管及牙槽骨等牙周组织的再生。这些发现表明，MSC外泌体可以作为牙周组织再生的无细胞策略，为外泌体应用于临床提供了基础。

2.5 牙齿组织再生

牙齿是一个复杂的器官，由牙釉质、牙本质、牙骨质和牙髓组织等组成，牙髓组织是牙齿中唯一的软组织，由牙本质包绕位于髓腔之内，有为牙髓牙本质复合体提供营养物质、传导痛觉、形成牙本质等重要作用。外伤、龋坏等都可导致牙体硬组织缺损，甚至使牙髓组织发炎从而坏死，恢复牙髓组织形态，可以恢复牙齿的功能性，以满足美学和生理的需求[49]。牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)显然是用于牙髓再生最适合的干细胞来源，DPSCs的外泌体也为牙髓再生提供了更多的可能性。Hu等[50]鉴定了DPSCs外泌体的miRNA表达谱，发现在牙源性分化条件下分离的外泌体miRNA下调LTBP1，通过TGFβ1/smads信号传导通路，促进牙源性分化。Huang等[51]评估了牙髓干细胞外泌体诱导牙源性分化的潜力，结果表明，外泌体可以与基质蛋白结合，附着于生物材料，通过内吞机制以剂量依赖性和饱和方式被DPSCs和人骨髓基质细胞(human bone marrow derived stromal cells，HMSCs)内吞，并触发P38-MAPK途径，促进牙源性分化；其体外实验结果也证明了外泌体可以触发牙髓样组织再生。血管生成对牙髓再生至关重要，Xian等[52]对DPSCs外泌体促血管生成的特性进行了研究，发现外泌体促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、促血管生成因子表达和血管形成，且抑制p38-MAPK信号可以增强诱导血管生成作用。不仅为DPSCs中的血管生成机制提供了新认识，还为牙髓再生提供了新策略。

5 小 结

综上所述，外泌体的研究为未来医学提供着越来越多的可能性，对包括骨、皮肤、血管和神经在内的各种口腔颌面部组织的再生均有效且有益，但外泌体是否可以完全替代干细胞疗法，应进行更系统的研究和评估。在过去的十年中，干细胞在人类疾病治疗中的应用引起关注，但移植的MSC会导致免疫排斥、遗传不稳定或功能丧失，外泌体作为无细胞疗法的介质，能够有效改善MSC移植的不良问题。作为旁分泌介质，外泌体在很大程度上可以概括亲代细胞的治疗效果，且目前MSC能够实现外泌体的大规模生产[53]，但外泌体在临床治疗上的安全性和有效性有待进一步研究，因此，在对外泌体进行设计和应用的同时，应做到特征明确；其次，需要对外泌体的miRNA、蛋白质等进行表征，并间接确定受到影响的细胞途径，揭示其内容物对受体细胞的真正意义。相对于干细胞的生产、储存、处理等的潜力而言，外泌体可能具有较大优势，随着学者们的不断探索和验证，外泌体将为再生医学提供新思路。