连接蛋白43的磷酸化在恶性肿瘤发生机制中的研究进展

赵希伟 刘倩 滕飞 侯林义 张文凯

缝隙连接(gap junctions)是由一系列连接蛋白组成的膜通道，连接蛋白是跨膜蛋白家族，可以形成连接相邻细胞的跨膜通道。缝隙连接蛋白(connexin，Cx)是组成缝隙连接通道的基础和形成细胞内外相互交流的重要条件[1]。连接蛋白是形成缝隙连接的亚基蛋白，六个连接蛋白齐聚形成半通道，两个半连接蛋白码头形成一个完整的间隙连接细胞间通道，连接蛋白的不同排列组合形成不同的膜通道，使其缝隙连接通道具有不同的功能[2]。连接蛋白是由多基因家族编码的包括多个成员的一类膜蛋白，Cx43是第一个发现的连接蛋白同时也是是表达最广泛的连接蛋白[3]。Cx43的作用可以概况为缝隙连接组装、门控、翻转以及对粘附连接、细胞骨架、细胞增殖及基因调控等方面发挥作用[4]。相邻细胞间发生信息的传递需要通过缝隙连接细胞间通信(gap junction intercellular communication，GJIC)。GJIC是指在相邻细胞之间提供直接、高效的细胞内外信息交换的过程。通过相邻细胞之间的缝隙连接进行的细胞间通信有助于将细胞组织变成功能性组织[5]。Cx43功能障碍可以影响缝隙连接，从而也影响GJIC，并可以影响小分子的细胞间交换，如cAMP，cGMP和Ca2+等，也证明Cx43功能障碍与多种恶性肿瘤密切相关[6]。本文就Cx43的磷酸化与恶性肿瘤发生机制的关系进行综述。

1 Cx43的磷酸化发生机制及作用

的研究显示Cx43的功能主要通过内化、磷酸化和降解来调节，但翻译后进行的磷酸化对恶性肿瘤的发生起非常重要的作用[7]。Cx43的磷酸化需要通过信号通路传递，例如通过蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)[8]、蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)[9]、酪蛋白激酶1(Casein kinase 1，CK1)[10]及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase MAPK)[11]等的信号通路。CX43的磷酸化改变了其结构及数量，也改变了缝隙连接的功能，进而影响缝隙连接细胞间通信，而缝隙连接通道的活性可能与缝隙连接通道的结构亚单位连接蛋白磷酸化状态有关[12]。蛋白质磷酸化被认为可以在从基因表达到蛋白质降解的几个步骤中控制细胞缝隙连接通讯，包括连接蛋白的翻译和翻译后修饰以及组装到质膜中并从质膜中移除，而大多数连接蛋白的磷酸化位点是在多个丝氨酸残基上，并在C-末端被优先识别[13]。可知蛋白质磷酸化介导的细胞间通讯的改变可以影响细胞的结构和生理功能的改变，严重者并可造成病理性改变如肿瘤[6]。

可增加Cx43磷酸化的激酶包括蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、酪蛋白激酶1(CK1)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等[14,15]。研究表明，PKC激活剂可以促进肿瘤的发生，机制是在PKC信号通路中，佛波酯肿瘤启动子TPA(PMA)刺激PKC，TPA通过诱导PKC对Cx43的磷酸化从而增加了Cx43磷酸化水平、降低了连接电导和增加了Cx43的周转率但也下调了缝隙连接通道的数量，同时也指出ser368是PKC在Cx43较常见的结合位点[9,14,15]。

与PKC和MAPK信号途径相比，Cx43的磷酸化通过PKA信号传导途径使产生的效应较差，通过提高细胞内cAMP的浓度，可以明显发现Cx43的磷酸化增强，也表示缝隙连接通讯加强。ser364是目前已知PKA途径中较常用的磷酸结合位点，Ser364磷酸化突变可以改变CX43的门控作用，可导致缝隙连接门控通道异常，可能会产生异位症的病变[8,14,15]。

Solan等[16]指出酪蛋白激酶1(CK1)的活性与Cx43半通道在缝隙连接斑块中的组装有关，CK1的抑制导致Cx43的增加和Triton-X-100不溶性缝隙连接的减少。CK1的磷酸化位点是Ser325、Ser328和Ser330[10]。而丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化位点Ser279和Ser282，该蛋白激酶的主要作用是加速缝隙连接通道的闭合[11,14,15]。

总之，可得出PKA可能通过提高连接蛋白的运输和组装加强缝隙连接通讯。CK1可能是通过促进缝隙连接通道的组装从而加强缝隙连接通讯。而PKC可能是通过抑制缝隙连接组装和通道的数量导致缝隙连接通讯被抑制。MAPK的作用可通过加速通道闭合来抑制Cx43的门控通道，抑制缝隙连接通讯。

2 Cx43的磷酸化与各种恶性肿瘤发生机制的关系

连接蛋白及GJIC与癌症的发生和发展有关，并且通常起着抑癌作用。连接蛋白的抑癌作用是由于缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的丧失和连接蛋白在肿瘤样本中表达的降低。在大多数研究中形成的癌症共识是GJIC在原发性肿瘤中出现了丢失，并且是肿瘤发生的重要驱动力。尽管在许多癌细胞中连接蛋白水平与GJIC之间存在相关性，但功能性的连接蛋白是通过翻译后修饰以及通过蛋白激酶信号通路进行的磷酸化实现的。连接蛋白可以作为抑制肿瘤的药物，但也可以促进肿瘤的生长和存活，特别是在晚期转移性疾病中。同时连接蛋白也可作为癌症的预后标志物和治疗癌症靶标的重要药物[17-20]。

2.1 Cx43的磷酸化与肺部恶性肿瘤 肺癌是男性中很常见的恶性肿瘤，是肿瘤死亡的常见原因[21]。Cx43与肺癌的关系密切，在正常肺中，Cx43处于低磷酸化状态，但在肺肿瘤中磷酸化的Cx43增加。Cx43调控肺癌时既可以是肿瘤抑制因子，也可以是肿瘤促进因子，因此肺癌中的Cx43磷酸化的表达既可以减少缝隙连接数量，也可以增加缝隙连接的数量，从而控制肺癌的疾病进程[17,22]。在肺癌中，通过PKC途径的Cx43磷酸化研究比较热门，Sun等[23]指出在肺癌中第二信使cAMP下游靶点cAMP(Epac1)的表达低于癌旁组织，而肺癌中的AKAP95(蛋白激酶A锚定蛋白95，通过与PKA的Ⅱ型R亚单位结合介导靶蛋白的磷酸化)明显高于癌旁组织，肺癌组织中蛋白激酶C(PKC)的阳性表达低于癌旁正常组织。研究表明Epac可诱导PKC活化和Cx43磷酸化[24]，也指出了Epac可以通过PKC途径导致的Cx43磷酸化状态参与了肺癌增殖的调控。同时也指出AKAP95的磷酸化需要PKC信号通路的参与。而在非小细胞肺癌(NSCLC)中，癌症相关成纤维细胞(CAFs)经历大量有氧糖酵解释放大量ATP，激活了PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路，使Cx43氧化磷酸化增强，促进Cx43组装不对称的单向GJIC，促进了肿瘤的恶性进展[25]。而在另一条信号通路中，p38 MAPK的活性，连接蛋白的磷酸化和肺癌转化之间存在着联系，p38 MAPK的调节与Cx43的磷酸化变化有关，该激酶可直接使该蛋白磷酸化[26]。

近年，研究的热点开始转向了解Cx43与肺癌干细胞的关系。Ruch等[27]指出Cx43在肺癌中可以抑制癌症干细胞(CSCs)的表达同时降低其含量，故若上调Cx43的表达也可以改善肺癌的病情进展。但Cx43磷酸化与肺癌干细胞的关系研究并不多见，这也可以为肺癌的治疗提供一个研究的方向。

研究Cx43的磷酸化与肺癌的具体机制目的就是可以为治疗肺癌提供更加高效的措施。在目前肺癌死亡率居高不下，可以尝试通过研究信号通路的机制治疗肿瘤，例如通过对PKC信号通路的抑制导致Cx43磷酸化的减少从而影响肿瘤的生长。同时，也可以通过CX43磷酸化抑制肺癌干细胞达到治疗肺癌的目的，提高肺癌患者的生存率。

2.2 Cx43的磷酸化与胃部恶性肿瘤的关系 胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，死亡率在恶性肿瘤中较高[28]。Ezrin的磷酸化作用通过信号通路可以影响Cx43的磷酸化进程，从而可以对胃癌产生影响[29]。因此我们首先了解研究Ezrin与胃癌的关系，Ezrin是Ezrin/radixin/moesin(ERM)家族的一员，参与了细胞膜和肌动蛋白细胞骨架之间的连接作用，也参与信号转导途径[30]。而与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP 2)的结合和苏氨酸567(T567)的磷酸化是Ezrin发生正确的空间构像变化的主要条件[31]。上述的两个条件产生的磷酸化也导致Ezrin激活，从而参与了各种正常生理过程和疾病的生理过程的调节。Bal等[32]指出在胃癌中幽门螺杆菌的状态与Ezrin的表达呈正相关，幽门螺杆菌感染的胃癌细胞中有更多的Ezrin表达。Tobo等[33]指出Ezrin的磷酸化作用可以参与胃癌的淋巴结转移，而且具有高度的侵袭性。随着越来越多的研究证明Ezrin在胃癌中表现出高表达，同时也有高度的侵袭性和参与淋巴结转移。Tang等[34]指出Cx43在胃癌组织中的表达比在癌旁正常组织中的表达明显减少，同时也指出Cx43的表达增多可能有助于胃癌的淋巴转移。Cx43在胃癌中的表达缺失会造成缝隙连接的数量和门控通道性质发生改变，导致缝隙连接通讯异常[35]。通过进一步的研究发现P-Ezrin和Cx43在胃癌中的表达呈负相关的表现，Cx43在胃癌中表达降低，而P-Ezrin在胃癌中表达增加，这可能是淋巴结转移和预后差的原因之一[29,36]。通过上述分析可得出磷酸化的Ezrin通过信号通路可能会导致Cx43磷酸化抑制了缝隙连接的通讯功能，导致细胞内外信息传达障碍。这也可能是胃癌发生的一个机制，也可以为今后的胃癌治疗提供药物靶点。

Cx43与PI3K在胃癌中的表达呈现负相关的关系[37]。PI3K-Akt信号通路是细胞内进行信号传导的重要通路,在肿瘤发生发展中起着重要的作用[38]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一种脂质激酶，其特征在于它们能够磷酸化肌醇磷脂中的肌醇环3’-OH基团以生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI(3，4，5)P3)，PI(3、4、5)P3是Akt转运至质膜所必需的第二信使，在该处其被磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)1和PDK2磷酸化并激活，Akt的激活通过磷酸化各种底物，活化的Akt可以抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成[38,39]。PI3K-Akt信号通路也是胃癌中的重要细胞内信号通路，通过实验证明在胃癌组织中PI3K呈现高表达状态也表明可能参与胃癌的形成[40]。Batra等[41]指出通过流体剪切应力(FFSS)的机械刺激PI3K，导致其下游的靶点Akt被磷酸化，通过PI3K-Akt信号通路直接刺激Cx43产生磷酸化的作用。由此也可推断出Cx43通过PI3K-Akt信号通路被磷酸化，导致Cx43的减少使缝隙连接通道的数量和结构发生改变，无法传递细胞内和细胞外的信号，从而无法抑制癌症细胞的过度增殖而形成胃癌[37]。综上所述，了解胃癌的发病机制可以为胃癌提供更加精确的治疗方法。

2.3 Cx43的磷酸化与肝部恶性肿瘤的关系 肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)占原发性肝癌的90%，也是死亡率较高的恶性肿瘤[21]。肝细胞中表达的主要缝隙连接蛋白是Cx32和Cx43，Cx32和Cx43的表达减少和异常定位可能与肝癌的发生密切相关，其中连接蛋白翻译后的磷酸化，与GJIC的功能破坏有关[42]。我们已知肝细胞癌可能与Cx43的磷酸化模式变化和重新分布有关，进而影响GJIC功能，为此在这里进一步讨论两者如何相互影响。

Cx43在肝细胞癌组织中的表达明显降低且存在分布异常，通过免疫荧光法得出缝隙连接在肝细胞癌的数量减少导致缝隙连接功能的缺失[43]。Ogawa等[44]指出通过小鼠体内体外实验Cx43高表达的情况下出现体外、体内转移、肿瘤具有高度的侵袭性。在蛋白的研究水平已经证明了Cx43在肝细胞癌中的作用，但通过在基因水平上的研究发现Cx43的mRNA水平无明显变化[45,45]。Cx43蛋白的明显降低和Cx43的mRNA无变化可分析出两种情况，分别是在转录后翻译出现差错或者在翻译后的蛋白质的加工修饰出现异常[46]。Lonta等[47]表示在大鼠的肝癌细胞中发现Cx43主要呈现的是磷酸化形式，也就证明了主要起作用的是翻译后的蛋白质加工过程出现了磷酸化。通过更进一步具体的研究发现在肝细胞癌中Cx43蛋白是由酪氨酸磷酸化转导信号通路进行表达同时出现缝隙连接通讯功能的缺失[42,48]。综上所述，Cx43的磷酸化在肝细胞癌的进程中起者重要的作用。随着研究Cx43磷酸化在肝细胞癌中作用机制的深入，将来有可能为肝细胞癌的临床治疗提供新的思路。

2.4 Cx43的磷酸化与乳腺癌的关系 乳腺癌是全世界女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是女性死亡的第二大原因(仅次于肺癌)。乳腺癌患者死亡最重要原因是发生肿瘤远处转移和侵袭[49,50]。在正常乳腺中，有3个常见的连接蛋白(即Cx43，Cx26和Cx32)，Cx43主要在腔上皮和肌上皮细胞中表达，特别是在肌上皮细胞(MEC)中更加明显，而Cx26的表达仅限于腔上皮细胞中，其中Cx43在乳腺实质中占主导作用。Cx43在正常乳腺组织中起着抑癌作用，它的表达减少或和定位不准确可能会进一步促进乳腺癌的发生，而且它在乳腺癌中的高水平表达可作为良好的预后标志物，而其在肿瘤后期的重新表达则有助于表明癌症发生了侵袭和转移。由于Cx43与乳腺癌患者疾病预后的改善呈正相关，因此Cx43也被认为是独立的预后因素[18-20]。Tishvhenko等[51]提出，Cx43既可调节这几个关键的癌症信号通路包括RhoA激酶(ROCK)，蛋白激酶A(PKA)，粘着斑激酶(FAK)和p38等，同时信号通路也可调节Cx43的磷酸化过程。

在乳腺癌中，Cx43磷酸化的发生主要通过各种信号通路实现。有研究通过应用一种特异性抗血清(SA226P)来检测正常乳腺、纤维囊性疾病(FCD)、乳腺癌中的原位癌和浸润性癌的连接蛋白43磷酸化形式(p-Cx43)的情况，我们发现，在原位癌中的MEC的p-Cx43出现了升高，但在浸润性癌中明显升高。在该实验中Cx43主要通过p44/42丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路在Cx43羧基末端的磷酸化位点Ser279和Ser282处被磷酸化[20,52]。乳腺癌的转移同样会引起Cx43磷酸化的改变，Bodenstine等[53]提出了新观点认为在乳腺癌发生转移过程中，细胞的缝隙Cx43含量水平不变的情况下，Cx43从胞浆到质膜的重新定位，以及通过PKA信号通路实现磷酸化后可以导致GJIC相应降低，也就表明癌细胞中的连接蛋白可能不是表达的下调而是通过改变与连接蛋白功能和或定位有关的调控途径来降低GJIC。乳腺癌细胞(BCC)容易向骨髓基质转移，故两者之间形成的GJIC的趋化性降低，外源性CXCL12在此过程中发挥重要作用。BCC之间相互联系并形成GJIC，CXCL12水平与Cx43表达之间存在反比关系即较高浓度的CXCL12情况下，Cx43表达量降低和Cx43磷酸化水平降低。也充分证明了外源性CXCL12作用于第二信使激活PKC信号通路导致Cx43的磷酸化，从而增加了细胞间的通讯[54]。Gakhar等[55]研究表明有机氯化合物TCDD对乳腺癌细胞的缝隙连接活性有抑制作用，同时Cx43和PKCα的磷酸化形式增加，因此TCDD通过PKCα信号通路磷酸化Cx43从而降低乳腺癌胞的GJIC。也由此得知在乳腺癌细胞中的Cx43羧基末端的磷酸化位点Ser368处可被PKC信号通路磷酸化，实现对GJIC的调节。有研究表明在乳腺癌中，PKC和细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)信号通路之间存在相互调节的关系。Cx43的磷酸化一方面可由PKC活化的ERK1/2信号通路实现，另一方面也可有PKC信号通路直接进行磷酸化[56]。在乳腺癌中，Cx43可作为预后的独立预测因子，通过对其信号通路磷酸化过程进行精准的调节，为治疗乳腺癌及其转移提供理论依据。

综上所述，Cx43在各个肿瘤的表达情况不一定相同，既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为癌基因[6]。Cx43表达的缺失引起缝隙连接功能异常，Cx43的缺失是主要通过蛋白质翻译后的加工修饰中磷酸化的作用实现的，加速了肿瘤的进展。因此，通过研究Cx43与各个信号通路的发生机制和探索各个信号通路的相互关系，进行更深入的研究，寻找治疗癌症的高效靶点，有益于新型治疗肿瘤药物的研发。