急性髓系白血病靶向凋亡途径治疗的研究进展

张肖肖 吴隼 吕国庆 刘宪凯 郁超

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,Aml)是成人中常见的急性白血病类型，中位年龄>65岁[1]。除了不良风险特征的频率增加导致标准诱导化疗的效果减少之外，老年Aml患者(60～75岁)通常合并有基础疾病，不适合强化化疗[2,3]。随着Aml分子学异常的发现，对其发病过程有了更加深入的理解，并为Aml患者提供了一些靶向治疗的机会[4]。尽管如此，其预后仍然很差，5年相对总生存(OS)率为20%～25%，仍需要我们探索新的靶向治疗方法以改善预后[5]。随着凋亡机制在Aml疾病进展及化疗耐药中重要性的日益增加，凋亡诱导疗法也得到了进一步发展，无论是否存在可靶向的基因突变，该疗法似乎都是有效的[6,7]。新出现的一种抗凋亡蛋白BCL-2小分子抑制剂Venetoclax已成功获得美国联邦药品管理局批准治疗慢性淋巴细胞白血病和Aml，这也证实了靶向凋亡策略已趋向成熟。凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，正常细胞的凋亡受到严格调节，而凋亡途径的失控已被认为是各种病理过程中的关键致病机制，且细胞凋亡的逃避或阻断已被认为是癌症的标志之一[8]。细胞凋亡由内源和外源两条平衡途径控制，最终激活细胞内半胱氨酸蛋白酶(caspase)，导致细胞凋亡。BCL-2家族成员是内源凋亡途径中的核心调节成员，该家族包括：抗凋亡蛋白(如BCL-2、MCL-1、BCL-XL)；促凋亡效应蛋白(如BAK、BAX、BCL-B)；BH3-only促凋亡蛋白(如BIM、BID、POMA、NOXA)[9]。p53是一种抑癌基因，可调控大量参与凋亡过程的靶基因，在内外凋亡途径中起着关键作用[10]。在Aml中p53功能障碍主要是由于结合蛋白或p53突变使p53蛋白失活，其中结合蛋白方面主要包括MDM2或MDMX的过表达[11]。在Aml中，抗凋亡和促凋亡蛋白表达的失衡或p53功能的丧失均会损害相关凋亡信号，从而促进白血病细胞无限制的生长[12]。本文旨在讨论Aml靶向凋亡途径治疗的发展及这一重要领域未来治疗进展的潜力。

1 通过内源凋亡途径

1.1 BCL-2抑制剂 在Aml中，抗凋亡蛋白(如BCL-2、BCL-XL、MCL-1)常常是过表达的，与白血病细胞的存活、不良预后及化疗耐药是密切相关的[13]。BH3-only促凋亡蛋白模拟物被认为是BCL-2蛋白家族的天然抑制剂，可激活下游BAX和BAK，促使线粒体膜间蛋白释放(如细胞色C),导致caspase级联反应激活，最终使细胞凋亡。[14]。Qbatoclax、Navitoclax等药物在治疗Aml过程中由于较高的非靶毒性或有限的临床活性而被限制进一步开发[15,16]。

Venetoclax是一种口服的选择性BH3-only促凋亡蛋白模拟物，其安全性和有效性在临床研究中得到认可。Konopleva等[17]应用Venetoclax单药(800 mg/d)治疗32例复发/难治Aml，客观缓解率(ORR)为19%，由于IDH突变的白血病细胞依赖于BCL-2生存，合并IDH突变患者ORR较高 (33%)。Chyla等[18]研究显示，除了凋亡蛋白的相对比例影响Venetoclax的临床疗效外，既存和治疗相关的FLT-3-ITD及PTPN11突变与其原发和继发性耐药有关。在应用Venetoclax治疗过程中，IDH1、IDH2突变与较高的应答率相关，而FLT3-ITD或PTPN11突变与低应答率有关。

Venetoclax单药治疗Aml结果显示出的反应是有限和短暂的，这一发现引发了与标准抗白血病药物联合治疗的相关研究。随后评估了Venetoclax联合去甲基化药物(HMA,如阿扎胞苷或地西他滨)或低剂量阿糖胞苷(LDAC)治疗新诊断的不适合强化疗的老年Aml的疗效，其中，HMA组患者的完全缓解/完全缓解伴血细胞不完全恢复(CR/CRi)率为18%～28%，中位OS为6～10个月，LDAC组患者的CR/CRi率为10%～15%，中位OS为5～7个月[19,20]。 在DiNardo等[21]进行的一项Ib期临床试验中，145例年龄≥65岁的新诊断Aml患者接受了Venetoclax联合阿扎胞苷或地西他滨治疗，CR/CRi率为67%，在具有不良风险特征患者中也获得了相似的应答率，中位缓解持续时间为11.3个月，中位OS为17.5个月，2年OS为46%。Wei等[22]研究中纳入82例年龄≥60岁的Aml患者，Venetoclax联合LDAC治疗的CR/CRi为54%，中位缓解持续时间为8.1个月，中位OS为10.1个月，由于在此研究中29%的患者曾应用过HMA，这可能部分解释了与阿扎胞苷或地西他滨联合Venetoclax研究结果之间的差异性。由此可见，Venetoclax联合HMA或LDAC的治疗效果明显优于单药治疗，并且似乎也优于接受标准7+3化疗的老年患者的治疗结果(2年OS为25%～30%)[23]。在上述研究中，患者治疗过程中常见的不良反应主要为可耐受的中性粒细胞减少性发热、血小板减少、恶心、腹泻等。

虽然这些联合方案在治疗不适合强化化疗的老年患者方面取得了重大进展，但具有高风险特征的长期预后仍然很差。在合并p53突变的患者中，尽管使用以Venetoclax为基础的联合方案治疗的CR/CRi率为45%～55%，但中位缓解持续时间仅为5～7个月，中位OS <8个月[24]。这就表明，即使这些 p53突变Aml患者的预后与HMA或LDAC单独治疗相比可能有所改善，但仍不理想。药效学研究表明，地西他滨半衰期较短，延长其疗程可能会杀灭更多的白血病细胞，而得到更好的治疗效果[25]。10 d地西他滨的ORR为40%～64%,在具有高风险细胞遗传学的患者中ORR为67%，在21例p53突变的患者中ORR高达100%[26-28]。DiNardo等[29]应用10 d地西他滨联合Venetoclax治疗168例新诊断的不适合强化化疗的老年Aml、复发/难治 Aml的ORR为74%，中位OS为6.0～18.1个月，中位缓解持续时间在新诊断的Aml及先前治疗的继发性Aml中未获得，在未治疗的继发性Aml及复发/难治 Aml中分别为5.1个月、16.8个月，30 d死亡率低至3.6%，60 d死亡率低至10.7%。其中合并RUNX1、FLT3、p53突变的CR/CRi率分别为90%、90%和70%。Kadia等[30]开展的一项克拉屈滨(Cladribine)联合LDAC或地西他滨进行交替治疗118例新诊断的老年Aml的Ⅱ期试验，中位OS可达13.8个月，ORR为68%。结合上述数据，该联合方案为新诊断老年Aml和复发/难治 Aml患者提供了有效的治疗，并且也可能成为异基因造血干细胞移植前的一种桥梁治疗方法。

白血病细胞功能性抗凋亡亚群的存在决定了Aml化疗的耐药性，化疗耐药细胞往往富含抗凋亡蛋白[31]。目前已经发现，白血病细胞可以通过几种不同的机制对BCL-2抑制产生抗性。例如，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活途径的上调可导致白血病细胞增殖和抗凋亡蛋白的稳定[32,33]。在一项针对复发/难治 Aml患者的Ⅰ期研究中，尝试将Cobimetinib (一种MEK1/2 MAPK途径抑制剂)或Idasanutlin (一种MDM2抑制剂)与Venetoclax联合使用，结果显示，使用Cobimetinib和Idasanutlin的ORR分别为18%和20%，其有效性需进一步评估[34]。此外，临床前研究表明MCL-1或表达的上调也可能在BCL-2耐药机制中起作用，仍需进一步证明。

1.2 MCL-1抑制剂 MCL-1是抗凋亡蛋白BCL-2家族成员之一，可通过阻断促凋亡蛋白(如BAK和BAX)的激活而发挥抗凋亡活性[35]。在原发性Aml复发时及Venetaclax应用过程中，MCL-1常常是过表达的，在临床上，MCL-1的抑制似乎与Venetaclax具有协同抗白血病作用，并且还可能逆转Venetaclax的耐药性[36-38]。许多临床试验评估了MCL-1抑制单药或与Venetaclax联合使用的安全性及有效性。Maritoclax是首次开发的MCL-1抑制剂，由于它可影响多种抗凋亡靶点，而使其临床应用受到限制[39]。随后开发了许多特异性小分子MCL-1抑制剂，如AMG397、AMG176、S64315、AZD5991，其中AMG397和AMG176的临床试验因一些参与患者出现突发性心力衰竭而被停止进行，结合临床前研究，考虑MCL-1的抑制可能与心力衰竭的发生有关[40-42]。

抑制MCL-1表达的策略不仅包括直接靶向MCL-1，还可通过破坏转录或翻译的间接靶向。周期蛋白依赖性激酶(CDK)通过控制基因的转录在调节基因表达方面起着重要作用，该酶的抑制可以优先减少短半衰期蛋白MCL-1的表达，目前CDK9抑制剂(Alvocidib)已进入临床试验，在阿糖胞苷(Ara-C)和米托蒽醌中加入Alvocidib来诱导治疗新诊断Aml，CR率高达70%，明显高于传统7+3方案(46%)，在MCL-1表达水平较高的Aml中Alvocidib的作用似乎更明显[43-45]。一种名为TP-1287的Alvocidib口服药剂，与其他抑制剂相比，对CDK9的抑制时间可能更长，抑制MCL-1效果更显著，可能对间接靶向MCL-1治疗Aml更具有临床意义[46]。Atuvecidib是CDK9的另一种选择性抑制剂，临床前研究表明，Atuvecidib具有良好的疗效和耐受性，临床研究正在进行中[47]。Dinaciclib是CDK1、CDK2、CDK5和CDK9的一种有效的抑制剂，在一项与吉妥珠单抗比较的试验中，虽没有观察到客观疗效，但其表现出较强的抗肿瘤活性[48]。其他几种正在开发的CDK抑制剂目前也进入了临床试验，如CYC065、TGO2101、BYA1251152、Vovucilib、AZD4573。

NEDD8活化酶可催化蛋白质降解过程中的限速步骤，而该酶抑制剂Pevonedistat便可加快细胞蛋白质的降解[49]。研究表明，Pevonedistat可通过上调NOXA与Venetoclax产生协同作用，也可以减少MCL-1 表达，作为一种间接MCL-1抑制剂发挥抗白血病作用[50]。

线粒体氧化磷酸化可促进白血病干细胞的存活，并且受BCL-2和谷氨酰胺水平的调节[51]。在临床前模型中，谷氨酰胺酶抑制剂可诱导细胞增殖停滞并激活凋亡途径，这可能会增强白血病细胞对Venetoclax的敏感性[52]。谷氨酰胺酶抑制剂在Aml的发展及其与BCL-2抑制的联合效果需进一步评估。

淋巴恶性肿瘤相关临床前研究表明，稳定BH3-only促凋亡蛋白NOXA与靶向MCL-1联合治疗可能是一种有效的方法。例如，应用脂肪酸合成酶抑制剂联合CDK抑制剂，在治疗套细胞淋巴瘤中取得较好的抗肿瘤活性[53]。此外，一种新的5-氮杂胞苷诱导白血病细胞凋亡的非遗传机制被发现，它可通过转录诱导BH3-only促凋亡蛋白NOXA来实现，并且在该研究中还表明，无论Venetoclax单药还是与5-氮杂胞苷的联合治疗Aml，NOXA的稳定表达是实现Venetoclax活性的关键决定因素[54]。由此可推测稳定NOXA与MCL-1或BCL-2抑制剂(如Venetoclax)联合治疗Aml时可能具有协同的抗白血病作用。

2 通过外源途径凋亡

凋亡抑制因子(IAPs)是一类具有抗凋亡功能的蛋白质家族，XIAP和CIAP1、CIAP2是这个家族的重要成员，IAPs的过度表达已被证明与Aml患者的化疗耐药及不良预后有关[55,56]。XIAP是IAPs家族中表达最广泛和最有效的抗凋亡蛋白质，而AEG35156可通过抑制其活性诱导细胞凋亡，增强白血病细胞对化疗的敏感性[57]。早期的临床试验表明，与单一诱导化疗方案相比，AEG35156联合化疗药物治疗难治性Aml患者的疗效更好[58]。然而，在随机Ⅱ期研究中并未表现出相似的良好效果，可能与其不能对靶点实现长期的有效抑制有关[59]。在诱导白血病细胞凋亡方面，RO-BIR2与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或Ara-C可能具有协同作用，进一步支持了评估这些药物的相关性研究[60]。

CIAP是IAP家族蛋白的另一个成员，其凋亡活性可被一种线粒体成分(SMAC)所拮抗，目前已被用于靶向治疗Aml[61]。Birinapant是一种SMAC模拟物，在大部分原发性Aml样本中可诱导细胞死亡:其中51%明显敏感，21%中度敏感，28%耐药，并且可以与其他化疗药物协同抑制白血病细胞[62]。在接受阿扎胞苷治疗的骨髓增生异常综合征患者中应用Birinapant 联合硫唑嘌呤治疗的一项Ib期研究表明，该联合方案具有较强的抗肿瘤活性，并且在HMA预处理的患者中也观察到相似反应，表明对HMA也具有一定的敏感性[63]。上述研究清楚地显示了SMAC模拟物对CIAP抑制的靶向效应和HMA增敏作用。随后对新诊断高危骨髓增生综合征或慢性粒单核细胞白血病患者进行了一项多中心、随机、安慰剂对照的Ⅱ期研究，比较了硫唑嘌呤单药及与Birinapan联合的疗效，结果表明2组缓解率无差异，但两药联合组产生了更大的药物毒性，由此，该研究被提前终止[64]。Brumatti等[65]进行的研究评估了caspase 抑制剂(Emricasan)与Birinapant的联合作用，Emricasan可以增强Birinapan诱导Aml细胞凋亡的敏感性。这两种药物的联合可能为Aml的治疗提供了一个潜在的机会。

IAP家族蛋白的另一个成员Survivin，在Aml中也是高表达的，其抑制剂已被开发出来。LY2181308作为Survivin抑制剂，可通过干扰细胞周期进程在体外诱导白血病细胞凋亡，并可与化疗药物产生协同促凋亡作用[66]。在一项LY 2181308单药及与Idarubicin和Ara-C联合治疗24例复发/难治Aml研究中，LY2181308单药除了使Survivin表达降低外，没有显示出有意义的反应，而应用联合治疗患者的CR率为25%，ORR率为56%[67]。

3 通过p53途径

在Aml患者中，若没有p53突变或缺失，细胞周期停滞和凋亡可通过p53蛋白或其下游途径的功能丧失而失调。其中，MDM2可与p53形成复合物，导致p53转录减少、核输出增加，并通过蛋白酶体降解增加[11]。由此，可通过抑制MDM2与p53间的相互作用以恢复p53途径来促使白血病细胞凋亡，在此方面，目前已经开发了多种化合物来靶向治疗Aml。

Nutlins，一种直接MDM2抑制剂，在MDM2扩增的异种移植模型中可显著降低白血病负荷，也可使人类白血病细胞显著凋亡[68,69]。目前已经开发了几种MDM2的小分子抑制剂，如RG7112、CGM097、AZD6244等，它们在细胞系和人类样本中均显示出了较强的抗白血病作用[70-73]。在Andreeff等[74]进行的试验中,116例Aml患者接受RG7112治疗后，其中 30例可观察到抗白血病活性，但仅有5例患者符合国际工作组的反应标准。为了提高药物选择性和安全性，第二代MDM2抑制剂RG7388 (Idasanutlin)已被开发，Yee等[75]进行了一项多中心Ⅰ、Ⅱ期研究来评估Idasanutlin作为单药或与Ara-C联合治疗复发/难治 Aml的安全性及有效性，Idasanutlin单药和联合Ara-C的CR/CRi率分别为21%和24%。有反应者的中位无进展生存期为315 d，无反应者为43.5 d。为进一步评估相关疗效，Idasanutlin联合Ara-C治疗复发/难治 Aml患者的Ⅲ期试验已开始。

MDM2抑制剂对RAS-RAF-MEK-ERK途径具有负性调节作用，可促进MCL-1的降解，因此，MDM2和BCL-2的双重抑制可协同增加Aml模型中的细胞凋亡[76,77]。在一项正在进行的国际Ib期研究中，>60岁复发/难治Aml患者获得的CR/CRi率为37%(11/30)，在Ⅱ期研究中应用推荐剂量Venetoclax，CR/CRi率为50%(9/18)[78]。这明显高于在相似人群中报道的Venetoclax单药或Venetoclax与HMA等药物联合治疗的应答率，表明靶向双重凋亡途径在临床上可能具有协同作用，并且在BCL-2/BCL-XL和BCL-2/MCL-1较高的患者中应答率可能会增加[79]。由于MDM2抑制剂的抗白血病活性依赖于功能性p53蛋白的存在，因此，这类药物在p53突变患者中的作用很大程度上是无效的。在治疗过程中，若检测到p53突变，这可能提示MDM2抑制剂已产生耐药[80]。

BCL-2抑制剂开发的逐步完善使得Venetoclax治疗Aml获得成功批准，不仅减少了药物的非靶毒性，而且也显著改善了患者的临床效果。虽然MCL-1抑制剂的积极开发仍在进行，但尚不确定这些抑制剂是否具有足够的安全性以便广泛应用。综合上述试验结果，考虑Venetoclax可能会成为治疗Aml的重要组成部分，并且联合使用活性药物(如HMA、LDAC)可以提高缓解率和长期疗效。在应用Venetoclax治疗过程中，耐药性是常见的，因为白血病细胞可上调其他重要的抗凋亡蛋白(如MCL-1和BCL-XL)以补偿BCL-2的抑制。因此，联合靶向两种或多种抗凋亡蛋白似乎是一个比较好的选择。通过将SMAC模拟物结合caspase-8抑制剂诱导的细胞死亡是一个新的研究领域，有可能成为新的联合靶点。最后，通过恢复p53活性是靶向Aml细胞凋亡的另一种手段，在临床上已显示出较强的抗白血病作用，特别是第二代Idasanutlin的使用。同样，与其他药物类似，MDM2抑制剂当与其他化疗药物联合使用时效果较好。

靶向凋亡途径是治疗Aml的有效策略,寻找与新型靶向药物的最佳联合方案可能是未来需要解决的关键任务。同样，为实现个体化治疗，识别预测性生物标志物以确定患者最佳的抗凋亡联合方案也是至关重要的。