结直肠癌患者血浆代谢物水平研究*

史祚秀，冯杰，刘洋，李硕，乔世峰

（1.锦州医科大学附属第一医院 普外科，辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学附属第三医院 病理科，辽宁 锦州 121000；3.山东大学齐鲁医院 ICU，山东 济南 250000）

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内其发病率位居第4 位，死亡率居第3 位[1]。早期结直肠癌的5年生存率约达90%，晚期则不到10%。因此，结直肠癌的早期诊断显得尤为重要[2]。结肠镜作为结直肠癌诊断的金标准，难以用于普通人群的筛选，且易受肠道准备及医生操作经验的影响。

代谢组学是近年来用于定量分析氨基酸、脂肪酸、核酸及糖类等小分子物质的新技术。随着对恶性肿瘤的深入研究，发现氨基酸、脂肪酸及糖类等可能在恶性肿瘤早期就已出现变化[3]。研究还显示，氨基酸代谢物的变化与恶性肿瘤的关系更为密切[4]。

本研究拟分析结直肠癌患者手术前后血浆氨基酸及肉碱代谢物水平的差异，探究结直肠癌患者血浆氨基酸代谢物及肉碱中有无可作为结直肠癌诊断的生物标志物，并为肿瘤代谢治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年9月—2019年8月在锦州医科大学附属第一医院普通外科住院的166例患者血液样本，将其分为实验组120例和对照组46例。实验组男性62例，女性58例；年龄32 ～89 岁，平均（65.29±10.40）岁。对照组男性21例，女性25例；年龄36 ～88 岁，平均（63.13±12.45）岁。结直肠癌临床分期依据美国癌症联合委员会第八版结直肠癌分期标准[5]。纳入标准：①病理检查明确诊断为结直肠癌；②年龄18 ～90 岁；③手术前未接受其他抗肿瘤治疗；④常规实验室检查未见异常；⑤常规影像学检查未见异常；⑥入院后经病理诊断为结直肠息肉或者腺瘤或者伴有消化道出血。排除标准：①其他部位肿瘤；②采用放化疗或靶向治疗；③严重代谢系统疾病；④血液系统疾病。本研究通过医院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器美国AB SCIEX 公司API 3200MD 质谱分析仪，日本岛津株式会社LC20A 液相色谱仪，系统控制和数据收集采用美国AB SCIEX 公司分析软件v1.6.0，数据预处理采用仪器自带的Chemo views 软件，配备的离子源是正离子电喷雾离子源（ESI+）。

1.2.2 试剂美国Thermo Fisher 公司乙腈和高纯度的水，美国Sigma-Aldrich 公司正丁醇和乙酰氯，甲醇（商业购买），12 种氨基酸同位素内标（NSK-A）和8 个肉碱内标（NSK-B）购自美国Cambridge Isotope实验室，质量控制（quality control, QC）标准品购自德国Chromsystems 公司。

1.2.3 样本收集所有受试者于晨起空腹条件下采用干血滴滤纸片法（DBS）针刺指尖采集血样，所有DBS 血样保存于4℃及时送检。

1.2.4 样本处理用打孔器将送检的DBS 滤纸片切割为直径3 mm 的纸盘（相当于3.2μl 全血），然后将其置于96 孔过滤板中，每孔加入含内标的无水甲醇，置于孔板震荡器室温下震荡20 min。用孔板离心机以1 500 r/min 离心2 min，将上层样板中的提取液通过滤过膜过滤并收集于下层样板中。每个样板随机选取4 个空白孔，分别添加2 个低水平和2 个高水平的QC 溶液，将上述滤出液和QC 溶液在氮气N2保护下吹干，干燥后的样本在65℃条件下用60μl 乙酰氯和正丁醇（1∶9）混合液衍生化20 min，衍生化的溶液在N2保护下再次吹干，最后将每个干燥的样本溶解在100μl 新鲜流动相溶液中以备进行代谢组学分析。

1.3 代谢组学分析

通过美国AB SCIEX 公司API 3200MD 质谱分析仪进行直接注射法质谱分析，该仪器在正离子电喷雾离子源下运行，每次运行时注入20μl 样本，以50%+50%乙腈，进行梯度洗脱。洗脱程序以0.2 ml/min开始，随后在0.08 min 内降到0.01 ml/min 并维持1.50 min，之后在0.01 min 内再次升高到0.2 ml/min并维持0.5 min。离子源喷雾电压设为4.5 kV，离子源气体压力设定为35 磅/ 平方英寸（psi）（1 psi=6.895 kPa），屏障气体压力设为20 psi，辅助气体温度保持在350℃，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析仪扫描方式采用母离子扫描（precursor ion,Prec）、中性丢失（neutral loss, NL）及多反应监测（multiple reaction monitor, MRM）3 种扫描模式。

1.4 统计学方法

数据分析采用Excel 和SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或配对t检验或方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆代谢物水平比较

两组丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、瓜氨酸（Cit）、谷氨酰胺（Gln）、甲硫氨酸（Met）、鸟氨酸（Orn）、脯氨酸（Pro）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tvr）、丁二酰基肉碱（C4DC）、葵酰基肉碱（C10）及二十四酰基肉碱（C24）比较，经独立样本t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），实验组较对照组升高。而天冬酰胺（Asn）、天门冬氨酸（Asp）、半胱氨酸（Cvs）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Glv）、同型半胱氨酸（Hcv）、组氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lvs）、苯丙氨酸（Phe）、胡椒酰胺（Pip）、色氨酸（Trp）、丙酰基肉碱（C3）、丁酰基肉碱（C4）、羟丁酰基肉碱（C4-OH）、缬氨酸（Val）、游离肉碱（C0）、乙酰基肉碱（C2）、异戊酰基肉碱（C5）、羟异戊酰基肉碱（C5-OH）、戊二酰基肉碱（C5DC）、戊烯酰基肉碱（C5：1）、己酰基肉碱（C6）、辛酰基肉碱（C8）、月桂酰基肉碱（C12）、肉豆蔻酰基肉碱（C14）、羟肉豆蔻酰基肉碱（C14-OH）、肉豆蔻二酰基肉碱（C14DC）、棕榈酰基肉碱（C16）、羟棕榈酰基肉碱（C16-OH）、羟棕榈烯酰基肉碱（C16：1-OH）、十八碳酰基肉碱（C18）、二十碳酰基肉碱（C20）、二十二碳酰基肉碱（C22）、二十六碳酰基肉碱（C26）及肉豆蔻烯酰基肉碱（C14：1）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组血浆代谢物水平比较 （μmol/L，±s）

表1 两组血浆代谢物水平比较 （μmol/L，±s）

组别 n Ala Arg Asn Asp Cit Cvs Gln对照组 46 146.685±51.362 5.643±3.394 68.463±23.749 24.494±8.760 24.674±9.084 1.345±0.730 8.003±4.134实验组 120 164.927±52.247 7.537±4.096 67.577±22.757 27.722±12.542 29.089±10.738 1.492±0.734 9.485±3.987 t 值 2.023 2.912 -0.236 1.654 2.582 1.229 2.257 P 值 0.045 0.004 0.814 0.099 0.010 0.220 0.025组别 Glu Glv Hcv His Leu Lvs Met对照组 176.900±55.727 191.458±61.584 8.622±0.826 66.775±55.929 99.656±30.560 127.119±76.229 15.833±4.429实验组 177.338±58.360 206.929±73.143 8.791±0.952 67.813±40.126 102.481±33.215 151.880±78.904 17.671±5.598 t 值 0.046 1.329 1.110 0.146 0.527 1.930 1.998 P 值 0.963 0.185 0.268 0.884 0.598 0.055 0.047组别 Orn Phe Pip Pro Ser Thr Trp对照组 12.790±4.915 46.817±21.731 242.953±94.378 405.181±199.432 47.969±13.417 22..603±7.927 40.823±10.193实验组 15.494±6.857 42.474±13.106 275.573±129.372 464.549±174.898 51.815±16.636 26.172±9.063 44.640±11.889 t 值 2.527 -1.760 1.613 2.020 1.402 2.462 1.922 P 值 0.012 0.080 0.108 0.045 0.163 0.015 0.056组别 C3 C4 C4-OH Tvr Val C0 C2对照组 1.446±0.504 0.161±0.069 0.042±0.024 54.830±16.219 143.245±36.039 26.072±8.309 14.200±5.335实验组 1.486±0.675 0.181±0.081 0.046±0.030 61.322±16.636 136.524±33.414 28.125±10.619 13.275±5.672 t 值 0.378 1.56 0.746 2.266 -1.212 1.227 -1.008 P 值 0.706 0.120 0.456 0.025 0.227 0.221 0.314组别 C4DC C5 C5-OH C5DC C5：1 C6 C8对照组 0.221±0.099 0.113±0.055 0.127±0.043 0.069±0.051 0.026±0.015 0.082±0.033 0.095±0.059实验组 0.291±0.171 0.116±0.062 0.142±0.071 0.075±0.045 0.030±0.025 0.087±0.050 0.117±0.097 t 值 3.684 0.296 1.895 0.713 0.958 0.616 1.477 P 值 0.000 0.768 0.061 0.476 0.339 0.539 0.141

续表1

2.2 不同临床分期结直肠癌患者血浆代谢物水平比较

结直肠癌患者0 期1例（由于数据过少，为防止对结果造成偏倚现象，故去掉），结直肠癌患者Ⅰ期14例，年龄53 ～81 岁，平均（66.79±8.74）岁。结直肠癌患者Ⅱ期50例，年龄43 ～86 岁，平均（64.96±9.74）岁。结直肠癌患者Ⅲ期40例，年龄46 ～89 岁，平均（64.63±10.16）岁。结直肠癌患者Ⅳ期15例，年龄51 ～82 岁，平均（70.2±8.97）岁。不同临床分期结直肠癌患者年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同临床分期结直肠癌患者C4DC 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C10 及C24 水 平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床分期结直肠癌患者血浆代谢物水平比较 （μmol/L，±s）

表2 不同临床分期结直肠癌患者血浆代谢物水平比较 （μmol/L，±s）

分期 n Ala Arg Cit Gln Met OrnⅠ期 14 164.484±40.252 6.176±2.330 30.468±9.145 10.464±2.905 18.711±6.019 14.922±4.332Ⅱ期 50 167.348±55.789 6.992±4.405 28.688±8.524 9.655±3.833 16.892±4.862 15.133±5.236Ⅲ期 40 166.621±54.157 8.167±4.322 31.966±14.226 9.068±3.795 17.321±5.431 14.881±6.093Ⅳ期 15 149.742±47.040 7.091±3.513 25.471±8.881 10.436±6.139 20.231±7.563 15.934±6.912 F 值 0.323 1.486 0.02 0.876 0.206 0.425 P 值 0.570 0.223 0.887 0.349 0.650 0.514分期 Pro Thr Tvr C4DC C10 C24Ⅰ期 473.424±147.125 27.483±6.962 65.204±15.734 0.309±0.219 0.115±0.070 0.029±0.017Ⅱ期 467.875±133.380 23.569±7.503 60.739±15.848 0.242±0.146 0.094±0.081 0.026±0.013Ⅲ期 502.134±244.446 26.777±8.684 63.879±14.283 0.295±0.143 0.106±0.069 0.026±0.013Ⅳ期 463.825±187.388 27.442±10.244 52.943±23.767 0.344±0.180 0.147±0.131 0.033±0.017 F 值 1.093 1.667 1.708 4.728 0.213 2.368 P 值 0.296 0.197 0.191 0.030 0.645 0.124

2.3 结直肠癌患者手术前后血浆代谢物水平比较

结直肠癌患者术前与术后Ala、Cit、Gln、Orn、Pro、Thr、C10 及C24 血浆代谢物比较，经配对样本t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；而Arg、Met、Tvr 及C4DC 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后Ala、Cit、Gln、Pro、C10、C24 水平较术前降低（P＜0.05）；而Orn、Thr 水平较术前升高（P＜0.05）。见表3。

表3 结直肠癌患者手术前后血浆代谢物水平比较 （n =119，μmol/L，±s）

表3 结直肠癌患者手术前后血浆代谢物水平比较 （n =119，μmol/L，±s）

时间 Ala Arg Cit Gln Met Orn术前 162.667±48.421 7.213±4.031 29.846±11.121 9.687±4.185 17.237±5.233 14.944±5.323术后 134.346±42.861 7.545±8.766 19.948±11.222 8.212±4.257 18.242±6.125 23.321±27.223 t 值 5.294 -0.414 6.991 2.619 -1.480 -3.212 P 值 0.000 0.680 0.000 0.010 0.142 0.002时间 Pro Thr Tvr C4DC C10 C24术前 479.133±190.451 25.501±8.103 61.548±14.586 0.263±0.143 0.104±0.077 0.027±0.013术后 353.314±134.323 28.170±11.436 64.390±20.070 0.238±0.138 0.063±0.050 0.023±0.012 t 值 6.160 -2.341 -1.26 1.955 5.133 2.579 P 值 0.000 0.021 0.210 0.053 0.000 0.011

3 讨论

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一[6]，其体内的代谢方式发生改变，特别是氨基酸代谢。氨基酸作为组成蛋白质的基本单位，参与体内多种生理及病理变化，本研究中使用LC-MS/MS 检测血浆代谢物水平的改变，并分析其是否可用于结直肠癌的早期诊断。

本研究结果显示结直肠癌组血浆中的Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C4DC、C10、C24 较对照组升高，与MIYAGI 等[7]研究结果基本一致。其中Gln 水平的变化与NISHIUMI 等[8]的研究结果相一致。Gln 是机体最丰富的非必须氨基酸，也是恶性肿瘤消耗最多的氨基酸。TODOROVA 等[9]认为，补充Gln 能够抑制IGF-1 激活的PI-3K/Akt 信号通路，而此通路是肿瘤生成和延长肿瘤细胞存活时间所必须的。Gln 也是肿瘤细胞中，除葡萄糖外的主要供能物质[10]，德国学者WARBURG[11]教授曾提出，肿瘤细胞即使在氧充足的情况下也主要依靠糖酵解来提供能量即Warburg 效应。由于Warburg 效应，恶性肿瘤产生的丙酮酸不能进入三羧酸循环，在ALT 作用下接受谷氨酸的氨基生成Ala。IKEDA 等[12]研究发现，结直肠癌患者血清中的Ala 水平也较对照组高。

此外，对结直肠癌患者行常规根治性手术治疗后，为减少手术对患者的影响，术后约1 周于晨起空腹采血行串联质谱检查。本实验结果显示，术后Ala、Gln、Cit、Pro、C10、C24 水平较术前降低，而Orn、Thr 水平较术前升高。推测Ala、Gln、Cit 及Pro 代谢物水平的前后变化最可能是因为手术去除肿瘤的结果，因此Ala、Gln、Cit、Pro、C10 及C24 与结直肠癌的关系更为密切，作为早期诊断结直肠癌标志物的可靠性更高。MA 等[13]分析大肠癌患者术前、术后的血清氨基酸，发现Val、5-氧代-L-脯氨酸等代谢物含量下降，而Tvr 上升，但哪些氨基酸更具有价值，还需要进一步研究。

本实验还对不同临床分期结直肠癌患者的血浆代谢物进行比较，以进一步研究其与该疾病严重程度的关系，结果显示Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期比较，仅发现C4DC 水平变化有差异，其他代谢物水平无差异。HIRAYAMA 等[14]研究显示，未发现结直肠癌患者代谢物水平与癌症分期有相关性。QIU 等[15]报道结直肠癌患者代谢物谱与癌症进展无相关性。也有研究表明，不同临床分期肿瘤患者的代谢物水平变化有差异[16-17]。本实验的结果可能也与血浆代谢物的测量方法、血浆代谢物的种类不全、覆盖的人群不够广泛、地域差异等诸多因素有关。因此，结直肠癌患者的严重程度是否与血浆代谢物水平相关，仍需进一步研究。

酰基肉碱是肉碱与氨基酸代谢物或脂肪酸结合的一种酯类物质，肉碱是氨基酸代谢和脂肪酸β-氧化代谢的中间体。当氨基酸代谢或脂肪酸氧化代谢发生异常，会造成相应的酰基辅酶A 蓄积，导致血浆中的酰基肉碱发生改变。肉碱的主要生理功能包括：①肉碱作为长链脂肪酸唯一载体，将长链脂肪酸转入线粒体内进行氧化，提供能量；②肉碱是调节细胞内外游离CoA 与酰基CoA 平衡的调节器。酰基肉碱的变化部分归因于肉碱棕榈酰转移酶2（CPT2）的下调，其下调促进了肝癌的发生。LU 等[18]研究揭示，15 种酰基肉碱在肝癌中存在统计学差异，其中不同临床分期的肝癌患者，其酰基肉碱也有差异。WILLIAMS等[19]研究证明，酰基肉碱、氨基酸及核苷等代谢谱在区分结直肠癌样本与非肿瘤上皮，以及疾病不同阶段（T1～T4）中发挥作用。目前检测血酰基肉碱是诊断脂肪酸氧化代谢最有特异性和最直接的方法[20]。

综上所述，本实验结果表明Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C4DC、C10 及C24 在结直肠癌早期预测中具有重要参考价值，Ala、Cit、Orn、Pro、C4DC 及C10 在结直肠癌早期诊断中具有重要意义。但由于样本量相对较少，对结直肠癌的早期诊断仍需要大规模的临床研究来进一步验证。