LvCTL1与WSSV复制的相互关系研究

邱 炜，陈义烘

(1. 贵州医科大学生物与工程学院，贵阳 550025; 2. 华南师范大学生命科学学院，广州 510631)

对虾是最重要的水产养殖经济动物之一，为世界粮食安全和经济增长做出了重大贡献[1]，对虾在我国水产经济品种养殖中占有重要的地位. 对虾养殖品种有凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei)、日本囊对虾 (Penaeusjaponicus) 及斑节对虾 (Penaeusmonodon) 等，其中L.vannamei是最主要的养殖品种. 随着对虾养殖产业的快速发展，尤其是高密度养殖模式带来的养殖环境恶化，导致对虾病害发生频繁，严重制约了对虾养殖产业的可持续发展. 病毒、真菌、细菌、寄生虫等都能导致对虾发病，其中白斑综合症病毒 (White Spot Syndrome Virus，WSSV)引起的白斑综合症 (White Spot Syndrome, WSS) 危害大、致死率高，是目前威胁对虾养殖产业的最主要病害[2-3]. 因此对WSSV复制机理的研究，能够为对虾WSS的防治提供理论基础.

凝集素 (Lectin) 是一类特异性识别糖基并与之非共价、可逆地结合的蛋白质, 其广泛存在于动物和植物[4]. 在研究凝集素的历史中，人们对凝集素的研究主要集中在高等植物，而对甲壳动物凝集素的研究较少. 甲壳动物缺乏免疫球蛋白，不具有特异性免疫反应，但却以独特的方式抵抗病原体的侵袭. 凝集素在甲壳动物非特异性免疫中发挥重要功能，其一般存在于血淋巴细胞中，具有类似于免疫球蛋白的作用[5-6]. 动物凝集素可分为多类，主要包括：C型凝集素 (C-Type Lectin，CTL)、F型凝集素、I型凝集素和P型凝集素等[6]. 目前已知，凡纳滨对虾CTL1 (LvCTL1) 重组蛋白对WSSV 表现出特异的亲和力，并且具有抑制WSSV复制功能[7]. 为了进一步了解LvCTL1与WSSV复制的关系，本文主要研究了体内条件下WSSV感染对LvCTL1表达的影响及LvCTL1表达对WSSV复制的影响，研究结果能为L.vannamei的WSS防控提供了更多理论知识.

1 实验部分

1.1 双链RNA的制备

使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega公司，美国)试剂盒体外合成双链RNA (dsRNA)[8]. 合成dsRNA所用引物序列见表1.

表1 所用引物序列Table 1 The primer sequences

1.2 WSSV的制备

将WSSV感染的L.vanname肌肉 (0.1 g) 切碎，然后在1 mL 1×PBS缓冲液 (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4) 中匀浆，4 ℃条件下5 000 g离心10 min后，将上清液通过0.45 μm膜过滤后获得病毒原液. 使用绝对定量PCR定量病毒拷贝数 (操作方法见1.4).

1.3 RNA干扰 (RNAi) 与WSSV感染

按1 μg/g的质量分数分别肌肉注射合成的dsRNA. dsRNA用PBS稀释，注射量为50 μL/尾. dsRNA注射后24、72、120、168 h，分别采集不同实验组9尾虾的鳃组织. 另外采集相同来源的未经任何处理的9条虾鳃组织作为0 h的样品. 每3条虾鳃组织混合在一起存于RNAlater©(Ambion公司，美国)，作为一个样本. 用相对定量PCR法检测基因表达结果 (操作方法见1.4).

对虾注射dsRNA 后48 h再注射WSSV (105拷贝数/尾). dsRNA和WSSV用PBS稀释，注射量为50 μL/尾. 在注射WSSV后24、48、72、120 h，分别采集不同实验组9尾虾的鳃和肌肉组织. 另外采集相同来源的未经任何处理的9尾虾作为0 h样品. 每3尾虾混合在一起作为一个样本. 鳃组织存于RNAlater©中，室温下放置1 h或4 ℃过夜后转移至-80 ℃保存. 肌肉组织直接放入-80 ℃保存.

1.4 绝对和相对定量PCR检测

采用Taqman探针法检测L.vanname肌肉病毒拷贝数[8]. WSV069引物和TaqMan荧光探针序列见表1. 以含有来自WSSV基因WSV069片段pMD19-T质粒作为内参. 使用基因组DNA提取试剂盒Ver.3.0 (TaKaRa公司，日本) 从肌肉中提取基因组DNA. 提取的DNA模板和内参质粒进行绝对qPCR，其程序为95 ℃ 8 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 25 s和72 ℃ 1 s条件循环40次. 每个样本进行3次绝对qPCR重复实验.

相对qPCR实验用于检测基因相对表达量. RNeasy Mini Kit (Qiagen公司，德国) 提取虾鳃的总RNA后，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司，中国) 将其反转录成cDNA. 按照SYBR©Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus，TaKaRa，日本)说明书进行相对qPCR实验，其程序为95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s和78 ℃ 1 s条件循环40次. 每个样本进行3次重复相对qPCR实验. 使用5倍稀释法获得标准曲线，进而计算引物扩增效率. LvCTL1、VP28和LvEF-1α扩增效率分别是 1.902、1.986和1.959. 实验用相对标准曲线法计算基因表达的差异[9]. 所用引物序列如表1所示.

1.5 组织病理学分析

注射dsRNA后48 h再注射WSSV (105拷贝数/尾). WSSV注射48、72、120 h后取虾的头胸部用AFA溶液固定，固定24 h后转入70%乙醇长久保存. 制作石蜡切片，用苏木精-伊红染色[10-11]. 每个组每个时间点分别选择3尾虾制作成9张切片，计数随机选择的3张切片(每尾虾1张)的总细胞数和感染细胞数，计算感染细胞数所占比例.

1.6 统计方法

计算3个样本的平均值和标准差 (SD). 实验结果以均值±标准差 (X±SD) 的形式表示. 使用student’st检验比较2个平均值之间的差异，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 注射dsLvCTL1能显著抑制LvCTLl表达

相对qPCR检测结果显示，注射dsLvCTL1后24～168 h，LvCTL1的表达显著下调 (P<0.05) (图1A).

虽然在24 h检测点基因表达已经有明显的下调，然而蛋白水平的下调在mRNA下调之后，所以选择注射dsRNA后48 h再注射WSSV. WSSV感染后，对L.vannamei鳃中LvCTL1的表达进行了检测 (图1B). 与0 h相比，LvCTL1的表达在所有检测点都显著上调 (P<0.01)，提示LvCTL1可能在WSSV复制中具有重要功能. 感染后，注射dsLvCTL1也能显著抑制LvCTL1的表达 (图1B)，表明在WSSV刺激显著上调情况下注射dsLvCTL1也能有效发挥其抑制作用.

图1 虾鳃组织中LvCTL1表达水平的检测

2.2 LvCTLl在WSSV复制中的功能

膜囊蛋白VP28是对虾的主要致病蛋白之一，在WSSV感染过程中起决定性作用[12-13]. 结果显示：在所有检测时间点中dsLvCTL1+WSSV组的VP28表达量(图2A) 和WSSV拷贝数(图2B)都高于dsEGFP+WSSV对照组，表明活体内LvCTL1起到抑制WSSV复制的功能.

为了进一步确认LvCTLl在WSSV复制中的作用，做了组织病理学分析. 在每个组每个时间点，来源于 3 尾虾的3张胃上皮细胞切片图被分析 (由于这3张切片结果是相似的，所以图3仅显示了1张切片图) . 结果显示：dsLvCTL1与dsEGFP对照组在WSSV感染后48、72、120 h的感染细胞比分别是44.7%与37.7%、56.2%与48.8%和80.0%与56.3%，该结果进一步确定活体内LvCTL1起到抑制WSSV复制的功能.

CLT是一种重要的先天性免疫因子，在抗感染中能识别病原体，其在对虾机体的免疫防御中具有重要的作用[6-7]. 目前已知，重组LvCTL1蛋白对WSSV 表现出特异的亲和力，且具有一定的抑制WSSV复制功能[7]，这表明LvCTL1在WSSV复制的过程中的可能具有重要作用. 为了进一步确认LvCTL1功能，本研究进行了活体RNAi实验. 结果显示:干扰LvCTL1表达后WSSV复制增加，这就说明LvCTL1在活体条件下起到抑制WSSV复制的功能. 上述结果显示：利用LvCTL1在WSSV复制中的重要作用研制出相应的免疫防治策略应用于白斑综合症的防治可能是一种可行的途径.

图2 经dsLvCTL1处理并感染WSSV的虾体内病毒感染水平检测

图3 感染WSSV对虾胃上皮细胞的组织病理分析

2.3 核因子-κB上调LvCTL1的表达

核因子-κB (Nuclear Factor-Kappa B, NF-κB)是一类重要的转录因子，其在机体的免疫反应、细胞增殖和分化、细胞凋亡等重要病理和生理过程中发挥重要的作用[14-15]. 然而，多种病毒却能激活进而利用宿主NF-κB来复制自己. 例如在被艾滋病毒1感染的细胞中，NF-κB被激活，然后增加长末端重复序列 (LTR) 驱动的病毒复制[16-17]. 激活的NF-κB通过作用于异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒LTR 上的NF-κB位点，进而增加病毒的复制[18]. 在L.vannamei中，已鉴定出2个NF-κB转录因子：LvDorsal和LvRelish[19-20].

本实验的检测样本来源于课题组以前的保存样本，其结果已经表明dsLvDorsal和dsLvRelish能分别有效抑制LvDorsal和LvRelish的表达[8]. 在本实验所有检测时间点，敲降LvDorsal和LvRelish后LvCTL1表达都被抑制 (图4)，表明LvDorsal和LvRelish能上调LvCTL1的表达. 结果显示WSSV感染后，机体通过LvDorsal和LvRelish上调LvCTL1表达进而抑制WSSV复制. 目前已知WSSV感染能显著激活LvDorsal和LvRelish的表达，并利用它们来复制自己[8]. 综合这些结果分析表明：L.vannamei中机体免疫与WSSV复制存在一个动态关系，提示WSSV感染后，L.vannamei机体启动免疫防御系统来抑制WSSV复制，而WSSV却利用机体免疫系统来复制自己.

图4 LvNF-κB对LvCTL1表达水平的影响

3 结论

WSSV感染后，L.vannamei机体可通过NF-κB上调LvCTL1表达. LvCTL1表达上调能抑制WSSV的膜囊蛋白VP28表达、病毒拷贝数和胃上皮细胞中的感染细胞数. 这些结果表明WSSV感染后，L.vannamei机体通过上调LvCTL1表达来抑制WSSV复制.