一种可富集Fe3+的含芘荧光探针

王 莎，黄子杰，肖盈希，卢 博，唐 健，马立军

(华南师范大学化学学院，广州 510006)

铁(Fe)是人体中一种不可缺少的化学元素，在很多生命活动中扮演重要角色[1-2]. Fe主要以亚铁离子(Fe2+)的形式存在于血红蛋白中[3]，结合并运输血液中的氧(O). 当人体内Fe含量过低时，会产生贫血症状，延缓智力发育和改变心理活动行为，造成免疫力下降等危害[4-6]. 当Fe含量过高时，又会给人体带来一系列的生理紊乱现象，如在人的肝脏中大量积累时，不仅会诱导肝硬化，还会使脂质的过氧化反应活性增强，打破人体内氧化、抗氧化体系的平衡[7-9]. 因此，检测和维持人体内Fe含量处于相对适宜的范围，对生理过程的正常进行且有重要意义.

目前，检测Fe3+浓度的方法有电化学、原子吸收光谱、等离子体发射光谱、生物和纳米传感及荧光探针等方法[10-12]. 与众多检测方法相比，荧光探针法具有高选择性、高灵敏度、强的抗干扰能力、制样简便快捷、可实时原位检测等优点[13-15]. 本文选择具有高荧光发射强度的芘作为荧光基团，通过生成酰胺键，与邻氨基苯甲酸结合，获得一种具有一定亲疏水性能的荧光探针芘甲酰邻氨基苯甲酸(PAA),羧基可提高其水溶性，同时也作为金属离子的结合位点. 探针与离子结合后，空间构型发生转变，导致亲水性的羧基与离子结合，整个探针分子疏水性增强，能从水溶液中析出，从而具有富集金属离子的能力.

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

主要仪器：荧光分光光度计(F-2500，日本岛津，溶液样品所采用的激发波长均为340 nm)、紫外-可见分光光谱仪(UV-1700，日本岛津)、氢核磁共振波谱仪(NMR Systems 400 MHz，美国瓦里安)、液相色谱-质谱联用仪(LCQ Deca XP MAX,美国安捷伦)、紫外分析仪(ZF5型手提式，金坛市宏华仪器厂)； pH计(PHS-3B，上海精科).

主要试剂：邻氨基苯甲酸、芘甲醛、石油醚、二氯亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、无水甲醇、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、柠檬酸、碳酸钠、AlCl3、CdCl2、BaCl2、CoCl2、Cr(NO3)3、CuCl2、HgCl2、FeCl3、Pb(NO3)2、NiCl2等，均为分析纯，无需进一步处理. 实验用水为去离子水.

1.2 探针的合成与表征

1.2.1 PAA的合成 利用芘甲酸和邻氨基苯甲酸合成PAA,其合成路线如图1 所示，分为2个步骤.

图1 PAA 的合成路线

(1)芘甲酰氯的合成. 将二氯亚砜逐滴加入芘甲酸的二氯甲烷溶液中，加热至40 ℃，回流搅拌7 h. 将产物通过减压蒸馏除去溶剂，得到芘甲酰氯.

(2)PAA的合成. 将新制芘甲酰氯和邻氨基苯甲酸分别溶解于二氯甲烷中，利用恒压漏斗，将芘甲酰氯溶液逐滴加入到邻氨基苯甲酸溶液中，在室温下搅拌24 h. 用去离子水洗涤3次，得到粗产物，分离有机相并用无水硫酸镁进行干燥，减压过滤得到滤液. 旋干滤液后，用二氯甲烷和乙酸乙酯(体积比为1∶1)作洗脱剂，采用硅胶柱层析进一步分离提纯，最终得到PAA.

1.2.2 PAA的表征 如图2A所示，PAA的1H NMR图谱(500 MHz，DMSO-d6)的化学位移和对应的质子类型归属：13.68 (s,1H,-COOH-),8.17～7.28 (m,4H,12.05 (s,1H,-CONH-),8.80～8.29 (m,9H,pyrene(H)),benzene(H)). ESI-MS(甲醇做溶剂)：分子式C24H15NO3，理论计算的相对分子质量为365.11，实验测试结果为364.00(图2B).

图2 PAA 的1H NMR及质谱图

2 结果与讨论

2.1 PAA识别Fe3+的光谱变化

图3A为PAA溶液(20.0 μmol/L)的紫外-可见吸收光谱，在波长分别为277 nm和345 nm附近有2个强的吸收峰，这是芘的特征吸收峰. 随着滴加Fe3+浓度的逐渐增大，PAA溶液的2个吸收峰强度明显减弱，这说明Fe3+与PAA发生了相互作用.

在激发波长340 nm、pH 4.00条件下，含DMSO体积分数为5%的PAA水溶液(20.0 μmol/L)在波长495 nm处有1个强的荧光发射峰(图3B). 根据文献[16]，该峰是芘的聚集发射峰. 向PAA水溶液中加入不同浓度的Fe3+溶液，发现波长为495 nm处的聚集发射峰强度随着Fe3+浓度的增大而降低，这表明PAA与Fe3+之间发生了结合，具有荧光识别的响应特性. 与此同时，还观察到白色絮状沉淀从溶液中析出，在波长为365 nm的紫外灯下，溶液从绿色逐渐变成无色(图3B插图a、b). Fe3+的存在使探针水溶液发生了荧光猝灭现象，并且Fe3+可以与PAA结合形成沉淀，从而达到富集Fe3+的目的. 因此，PAA对Fe3+具有检测、富集双重功能.

图3 PAA溶液中加入不同浓度Fe3+时的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱

2.2 PAA识别Fe3+的选择性和抗干扰性能

在相同条件下，向PAA水溶液中分别加入浓度为30.0、60.0、90.0、120.0 μmol/L的Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Ba2+、Pb2+、Fe2+等7种常见重金属离子溶液后，测试激发波长为495 nm时的荧光发射光谱(图4A). 以荧光强度的相对变化值(I-I0)/I0作为参考指标，只有滴加Fe3+时才能使PAA溶液的荧光发射峰强度产生明显变化，而对于其他离子，即使浓度较高，也不会产生白色絮状沉淀物，只出现相当微弱的荧光猝灭. 该现象进一步说明了PAA对Fe3+具有高选择性的富集能力和荧光识别响应，因此，PAA可作为Fe3+的荧光探针.

图4 不同金属离子浓度对PAA荧光发射峰强度的影响及其干扰性

为了证明PAA具有特异性识别Fe3+的应用潜力，考察实际水样中当其他金属离子存在时，PAA对Fe3+的识别和富集是否受到干扰，即同时向PAA水溶液中加入Fe3+与其他金属离子. 当其他金属离子的浓度为Fe3+浓度(30.0 μmol/L)的5倍时，只有Cr3+和Cd2+能够使探针溶液的荧光发射峰强度发生极其微弱的增强，对其他金属离子(如Cu2+、Mn2+、Ni2+等)几乎没有任何影响(图4B). 这说明PAA在水溶液中对Fe3+的识别具有很强的抗干扰能力.

2.3 PAA与Fe3+的结合比和结合常数

为了探究Fe3+与PAA的结合模式，进行滴定实验. 控制PAA与Fe3+的总浓度为20.0 μmol/L，调节PAA与Fe3+的浓度之比并测试荧光强度，计算波长为495 nm的荧光强度在Fe3+加入前后的差值(I0-I)对Fe3+所占浓度比c(Fe3+)/[c(Fe3+)+c(PAA)]作图，即得Job’s plot图(图5A)，由图中最大值对应的横坐标0.3可近似测算，PAA与Fe3+形成稳定螯合物时PAA与Fe3+的最佳结合比(物质的量之比)为2∶1,即2个PAA分子可结合1个Fe3+形成稳定的络合物.

图5 不同离子探针比例对PAA荧光发射峰强度的影响及其在最佳结合模式下的拟合曲线

结合文献的方法，利用Levenberg-Marquardt algorithm[17]进行曲线拟合，以波长为495 nm 处荧光强度的差值比(I-I0)/(Imin-I0) 表示PAA的残余浓度，利用反应式和公式

(1)

(2)

进行非线性拟合，其中G代表Fe3+，H代表PAA，a为常数，K21是PAA与Fe3+的拟合常数. 通过拟合结果计算得到PAA与Fe3+的结合常数K21高达3.075×1012(图5B)，说明探针分子PAA和Fe3+之间的结合非常稳定.

以上结果表明：1个Fe3+离子能够与2个PAA分子结合形成沉淀. 该结果与实验预期一致，都显示了探针分子上唯一的结合位点——邻氨基苯甲酸上的羧基与Fe3+的结合作用产生了沉淀，1个Fe3+与2个探针分子中极性较大的羧基结合，提高了Fe3+-探针复合物的疏水性能，从溶液体系中析出，产生荧光猝灭现象，即荧光识别响应.

3 结论

以芘为荧光发射基团、邻氨基苯甲酸基为识别基团，合成了一种对Fe3+具有高选择性荧光识别作用的水溶性荧光探针——芘甲酰邻氨基苯甲酸. 在含DMSO体积分数为5%的水溶液中，对Fe3+表现出荧光猝灭现象，且产生絮状沉淀，实现了同时对目标离子产生荧光识别响应和富集作用. 该探针表现出高灵敏性、高选择性、强抗干扰能力和多功能性，具有一定的应用潜力.