早发性卵巢功能不全与昼夜节律紊乱关系的中西医研究进展

韩昕宇，冯晓玲,吴天强，李强

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

早在秦汉时期，中医古籍《黄帝内经》中就有关于日节律、月节律、年节律的记载，其以“生气通天”“天人相应”为理论基础，从阴阳消长节律、营卫运行节律、子午流注纳支等多个角度阐释了人体的生命活动会随着自然界的昼夜交替而发生相应的节律性变化。现代医学则认为昼夜节律是生物体为了更好地适应外界的环境而在进化过程中所作出的改变，是自然选择的结果。昼夜节律的形成和维持受生物钟基因的调控，研究证实[1]下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamicpituitary-ovarian axis，HPO)中含有多种生物钟基因的表达,故生物钟紊乱导致的昼夜节律异常可影响女性的生殖功能，参与多种生殖疾病的发生与发展过程。早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency，POI)可表现为昼夜节律的紊乱，POI患者多伴有昼夜节律紊乱所致的睡眠障碍等临床表现。近年的一项研究[2]比较了61例POI患者(POI组)和61例卵巢功能正常女性(对照组)的睡眠质量和疲劳感，两组的匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)分别为7.69±4.18和8.03±4.53,P=0.79，POI组的PSQI低于对照组，虽与对照组比较差异无统计学意义,但POI组的入睡时间显著长于对照组(分别为1.74±0.66和1.18±0.87,P<0.001)，疲劳指数也显著高于对照组(分别为5.25±2.78和3.49±1.78,P<0.001)。反之，睡眠质量差亦可导致卵巢功能减退，国内学者[3]通过多因素 Logistic 回归分析方法探究了卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)的发病因素，结果表明睡眠质量差是POI的终末状态POF发病的高危因素之一。并且在一项对接受体外受精妇女的队列研究[4]中发现，与只在白天工作的妇女相比，上夜班或轮夜班的妇女成熟卵母细胞数和总卵母细胞数、窦卵泡总数均较少，且雌二醇(E2)的峰值水平较低，这表明扰乱昼夜节律的职业因素可影响卵母细胞的质量及卵巢分泌的激素水平，加速卵巢的衰老。故现将POI与昼夜节律紊乱关系的研究进展综述如下。

1 中医对POI及昼夜节律的认识

1.1 中医对POI病名及病因的认识

中医中没有针对POI的特定病名，根据其临床表现可对应中医的“经水早断”“月经过少”“闭经”“妇人脏燥”等疾病。《傅青主女科》言:“经水早断，似乎肾水衰涸，吾以为心、肝、脾、气之郁者”，《女科证治准绳·调经门》曰：“经水涩少，为虚为涩”。《素问·阴阳别论》云: “二阳之病发心脾，有不得隐曲，女子不月。”《金匮要略·妇人杂症脉证并治》曰：“妇人脏燥，喜悲伤欲哭，象如神灵所作，数欠伸。”古籍中的记载表明古代医家已对POI的病因及表现有了一定的认识。近代医家如国医大师柴嵩岩教授[5]认为阴血亏虚、肾气不足、脉络瘀滞等因素与POI的发病有关，其主要证型可分为肝肾阴虚、脾肾阳虚, 多兼夹肝郁、湿浊、血热、瘀阻之证。亦有韩延华教授[6]认为POI的病因主要责之于肾，肾虚则精血不足，致冲任无法按时满溢，胞宫无血可下。而肾气亏虚日久，气虚血液运行不畅，必致瘀血阻滞，故瘀血阻脉是POI发生的病理因素。王秀霞教授[7]认为POI应从肝脏论治，以寒、郁为其主要病理因素，并主张从“天人合一”的整体观角度出发，全面考虑患者就诊时所处年份的运气，地区的气候、日节律的紊乱及个人体质等因素进行遣方用药。

1.2 中医对昼夜节律的认识

中医对昼夜节律的认识可以追溯到两千多年前的《黄帝内经》，其从阴阳消长节律、营卫运行节律等方面阐释了人体正常生命活动节律性变化的规律。《素问·金匮真言论》曰：“平旦至日中，天之阳，阳中之阳也；日中至黄昏，天之阳，阳中之阴也；合夜至鸡鸣，天之阴，阴中之阴也；鸡鸣至平旦，天之阴，阴中之阳也，故人亦应之”。《内经》中的这段内容将一昼夜分为平旦到日中、日中到黄昏、合夜到鸡鸣、鸡鸣到平旦这四个时间段，揭示了自然界阴阳之气昼夜消长变化的规律，人体的阳气亦会随着自然界昼夜交替而发生相应的节律性变化。正如《素问·生气通天论》中所记载：“故阳气者，一日而主外。平旦人气生，日中而阳气隆，日西而阳气已虚，气门乃闭”。《灵枢·大惑论》曰：“夫卫气者，昼日常行于阳，夜行于阴。故阳气尽则卧，阴气尽则寤。”这句话体现了人体卫气的昼夜运行、阴阳之气的昼夜消长与睡眠之间密切的关系。生理情况下，白天阳气充盛，故人体精力充沛，夜晚阴气旺盛，故人夜卧而寐。若体内处于阴阳失调的病理状态，则会出现昼夜节律紊乱，阳不入阴、阴不出阳则表现为“昼不精而夜不瞑”，反之，若长时间熬夜、夜深而不欲寐，亦会扰乱昼夜节律，耗伤营阴，致使阴阳消长失衡，进而导致疾病的发生。不仅在疾病的病机层面，在治疗疾病时中医也会强调“谨候其气之所在而调之,是谓逢时”(出自《黄帝内经》)，充分地考虑昼夜人体生理状态的不同，顺应人体脏腑阴阳的昼夜运行规律，择时用针、用药，从而提高治疗效果[8]。

2 调节昼夜节律紊乱在中医治疗POI辨证思路中的体现

中医治疗POI时有多种辨证思路，临床上POI患者多有睡眠障碍、容易疲劳等昼夜节律紊乱的表现，同时若患者有长期熬夜、日夜颠倒的不良生活习惯亦会进一步加快卵巢功能的减退，形成恶性循环，故在治疗上较为棘手。著名妇科专家罗颂平教授[9]从阴阳论治POI，在临床中常用归肾丸、左归丸作为基础方进行加减，其具有滋阴补肾，调和阴阳的功效，暗合阴阳失调，肾阴耗伤，进而水不涵木，木郁化火，上扰心神所致昼夜节律紊乱的病机特点。王秀霞教授[7]亦认为POI患者更应注重作息的规律，尽量在晚上11点前入睡。《针灸聚英·十二经脉昼夜流注歌》曰:“肺寅大卯胃辰宫，脾巳心午小未中，申膀酉肾心包戊， 亥焦子胆丑肝通”，中医认为夜间11点—1点为肝经运行之时，“夜卧则血归于肝”“女子以肝为先天”“女子以肝和为贵”，肝气的条达影响着女子的排卵与月经的来潮，若POI患者长期夜深不寐，则会进一步加重昼夜节律紊乱，同时导致肝失疏泄、肝血不足，进而加快卵巢功能的衰退。国医大师夏桂成教授[10]创立了“心(脑)-肾-子宫轴”学说，提出“心不宁则肾不实、心不静则阴不足”的理论用于指导妇科疾病的治疗，夏老认为POI是心(脑)-肾-子宫轴功能紊乱，心肾不交所致。心火偏旺，则会耗伤肾阴，导致癸水不足，血海不充，出现卵巢功能减退的病理情况。如今现代女性承受着更多来自家庭和社会的压力，常有紧张焦虑，心神不安，失眠多梦等心不宁，心不静的证候表现，故在临证治疗中重视应用“交通心肾、宁心安神”的治法来改善患者昼夜节律紊乱的症状。综上所述，近现代妇科医家在治疗POI时多应用调和阴阳、交通心肾、宁心安神等治法，并嘱患者注意作息规律，这与调整昼夜节律紊乱的思路不谋而合。

3 现代医学对POI及昼夜节律紊乱的认识

POI是指女性在40岁之前出现卵巢功能衰退的临床综合征，以月经紊乱伴高促性腺激素及低雌激素为主要特征[11]。在临床表现上，POI患者会提前出现潮热、盗汗等围绝经期症状，其远期骨质疏松、心血管疾病的发病风险也会增加。西医目前认为POI的病因与染色体遗传、自身免疫、医源性因素、感染、个人生活行为等因素有关，但仍有部分POI患者病因不明确[12]。

昼夜节律的产生和维持由位于下丘脑视交叉上核(SCN)的中枢生物钟及外周器官组织的外周生物钟调控，中枢生物钟作为生物节律的起搏器，可接收由视网膜上特异性黑视素传递至SCN的光信号，然后通过神经-体液调节系统同步心、肾、肝、卵巢等外周器官组织的昼夜节律变化，协调全身器官和细胞的分子节律[13]。在分子水平昼夜节律由生物钟基因和蛋白构成的转录-翻译反馈环路调控，目前研究已发现的生物钟基因包括核心基因circadian locomotor output cycles kaput(Clock)，brain and muscle Arnt-like protein 1(Bmal1)和钟控基因Cryptochrome1-2(Cry1-2)，Period1-3(Per1-3)，RAR-related orphan receptor alpha(Rorα)等，其核心反馈调控环路如下：Bmal1与Clock相结合形成异源二聚体，从细胞质进入到细胞核，然后在转录翻译水平调控Period和Cryptochrome的表达。而当Per1-3、Cry1-2等蛋白的水平在胞质内达到一定浓度时，则又会重新转位至细胞核，抑制Clock-Bmal1二聚体的转录活性，进而使Per和Cry的转录活性受到抑制，由此发挥反馈调节作用[14]。

4 昼夜节律紊乱与POI的关系

始基卵泡是卵巢储备的唯一形式，在胚胎时期始基卵泡库便已建立，之后会在卵泡激活或闭锁的过程中逐渐减少，在每个月经周期仅有一小部分始基卵泡进入生长发育阶段，经过始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡，最后发育为成熟的排卵前卵泡[15]。在卵泡发育过程中任何一个环节的异常都可导致卵泡募集异常、闭锁加速，进而使卵泡过早耗竭、卵巢储备减少甚至衰竭。现将目前昼夜节律紊乱与POI关系的研究进展从始基卵泡的激活与发育、排卵及性激素的生成、卵母细胞的衰老这3个方面归纳如下。

4.1 昼夜节律可参与调控始基卵泡的激活与发育

在一项持续22年的随访研究[16]中发现，与没有轮夜班的女性相比，轮夜班工作20个月及以上的女性绝经年龄提前的风险显著提高。这提示昼夜节律紊乱可能导致始基卵泡的提早激活进而使卵巢功能提前衰竭。早年已有大量的动物研究证实昼夜节律基因(Bmal1、Clock、Per2)在颗粒细胞和黄体中均有表达，其对卵泡的发育和甾体激素的生成有重要作用[17]。更有研究[18]利用昼夜节律基因敲除小鼠模型来探究其在卵泡发育中的调控作用，在卵泡膜细胞Bmal1特异性敲除的卵巢中发现始基卵泡被提早激活，证明了昼夜节律可参与调控始基卵泡的激活。ZHENG Y等[19]为了探究昼夜节律基因Per1/Per2双突变对卵泡发育的影响，收集了不同周龄(3、8、26和52周)小鼠的卵巢，对原始、初级、次级和窦状期的卵泡数量进行组织学分析，结果发现Per1/Per2双突变小鼠在大约20周时表现出雌性生育力的下降，从32周开始出生的幼鼠明显减少。在26周龄和52周龄时，Per1/Per2突变体的卵泡数均显著低于同胎对照组，表明Per1/Per2的突变可导致卵泡储备过早耗尽，致使生殖能力下降，提示昼夜节律紊乱及其潜在的调控网络可能是POI发病的重要因素。除了动物研究以外，近年还有一项研究[20]为探讨人类颗粒细胞中是否存在昼夜节律基因及它们的表达与卵巢功能的关系，从接受体外受精治疗的年轻(18～33岁)和年龄较大(39～45岁)妇女的卵泡液中分离出人黄素化颗粒细胞，在用人绒毛膜促性腺激素刺激后的36 h，通过qPCR分析了昼夜节律基因Cry1-2、Per1-2、Clock、Arntl1-2和Npas2的mRNA表达水平。结果发现以上所有的昼夜节律基因在培养的人黄素化颗粒细胞中均有表达，且这些基因在年龄较大妇女细胞中的表达呈下降的总趋势，但只有Per1和Clock基因具有统计学意义。这项研究表明在人黄素化颗粒细胞中确实存在昼夜节律基因，且在卵巢衰老过程中昼夜节律基因的表达会减少，证明了昼夜节律与卵巢功能有着密切的关系。

4.2 昼夜节律可参与排卵及性激素的生成

促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)激增可导致卵泡破裂，是即将排卵的可靠标志，ERIC等的研究[21]发现多种细胞类型的昼夜节律功能对于LH峰的适当时机是必要的，昼夜节律紊乱可改变LH激增时间，扰乱卵巢周期。控制昼夜节律的SCN区中枢生物钟可驱动促性腺激素释放激素(GnRH)的节律性释放，刺激促卵泡生成素(FSH)和LH的分泌从而参与排卵过程[22]。SCN还可分为核心神经元和壳层神经元两个区域，两者分别可产生血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)和精氨酸加压素(Arginine Vasopressin,AVP)两种神经肽，VIP可通过刺激GnRH神经元参与HPO轴的调控，AVP受Clock-Bmal1二聚体的正性调节，可作用于前腹侧脑室周围核(Anterior ventral periventricular nucleus,AVPV)激活kisspeptin(Kp)神经元，Kp神经元在昼夜节律功能中起着重要作用，其可诱导LH的释放和排卵，通过控制神经内分泌参与调整包括人类在内的所有哺乳动物的生殖活动[23]。国内有学者[24]通过腹腔注射70 mg/kg剂量的环磷酰胺构建POF小鼠模型，然后观察POF组与对照组小鼠卵巢中kisspeptin的表达情况，发现两组小鼠卵巢的卵泡颗粒细胞中均有kisspeptin的表达，与对照组相比，POF组小鼠血清中E2水平显著降低，FSH水平显著升高(P<0.01)，并且卵巢次级卵泡中的kisspeptin、kiss1r阳性细胞数也显著减少，进而推断POF小鼠血清中FSH水平的升高可能与其卵巢中kisspeptin表达的减少降低了卵泡对FSH的敏感性有关，促使大量初级卵泡被募集，最终导致卵母细胞过早耗竭。

性激素的水平可用于评估卵巢的储备功能，昼夜节律基因Per2和Clock在黄体的类固醇生成细胞中有节律地表达，可参与类固醇激素的生成，有研究证实可通过抑制 Clock/Bmal1异二聚体来抑制固醇合成急性调节蛋白(STAR)的表达进而抑制黄体酮的产生[19]。NAGAO S等的研究[25]用人颗粒KGN细胞(人卵巢颗粒细胞系)研究了昼夜节律基因表达与卵巢甾体激素生成之间的功能联系，发现siRNA敲除Clock基因可通过抑制芳香化酶的表达而显著降低雌二醇的产生。LI Y等人的研究[26]观察到24 h暴露于光照条件下短时间(不到2周)可导致卵巢总卵泡数量减少和昼夜节律相关基因的下调。同时还检测到血清性激素水平的变化，其中LH、FSH的浓度增加，而孕酮的浓度减少。此外，还导致了卵巢中TUNEL阳性细胞数量以及DNA损伤和修复相关基因Rad51、Brca1和Rec8的mRNA表达水平显著增加。这些结果表明光照周期延长模拟的昼夜节律改变，可通过引起激素水平的变化导致卵泡数量减少，还可导致DNA损伤并破坏其修复，进而诱导细胞凋亡损害卵巢的发育。

4.3 昼夜节律相关因子可抑制卵母细胞衰老

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是在昼夜节律调控中的关键去乙酰化酶,其可通过去乙酰化昼夜节律相关蛋白来影响昼夜节律，可作为改善昼夜节律紊乱的治疗靶点，具有抗氧化、抗衰老、延长寿命的作用[27]。有研究表明[28]SIRT1基因的敲除或抑制其表达可影响组蛋白H3和Bmal1的去乙酰化，进而导致昼夜节律紊乱。近年来的研究[29]表明当小鼠的卵母细胞特异性SIRT1过表达时，可通过连续激活FOXO3a和抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)来提高卵巢储备功能，延长卵巢寿命。mTOR是细胞生长和增殖的重要调节因子，位于PI3K-AKT信号通路的下游，PI3K-AKT-mTOR通路激活可通过抑制自噬来促进细胞衰老[30]。在这项研究中还发现SIRT1敲入小鼠的始基卵泡数量及百分比高于野生型小鼠，并且卵泡闭锁的数量也小于野生型小鼠，这些结果证实SIRT1可通过调控PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制始基卵泡的启动及凋亡进而保护卵巢储备功能。在近年的药理研究[31]中亦发现人参皂苷Rg1在D-gal诱导的卵巢早衰小鼠模型中所起到的促进E2和LH分泌，提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的表达从而减轻卵巢氧化损伤进而改善卵巢储备功能的作用，是通过靶向调控卵巢组织中的SIRT1表达而实现的。除此之外，昼夜节律紊乱调节因子SIRT1还可通过调节线粒体功能、改善卵母细胞质量等途径改善卵巢功能[32]。

5 调节昼夜节律对POI治疗作用的现代研究

5.1 褪黑素

近年有多项研究[33-34]证实归属于POI的卵巢储备功能减退(Decreased ovarian reserve，DOR)和POF患者存在明显的睡眠障碍问题和较高的焦虑抑郁发生率。褪黑素是由松果体产生的神经内分泌胺类激素，其分泌受SCN内的昼夜节律钟控制，表现出明显的昼夜节律性，可参与调控哺乳动物的昼夜节律[35]。外源性补充褪黑素可调整昼夜节律紊乱，SHABANI等[36]的临床观察结果显示，与相同剂量的安慰剂相比，持续12周每晚睡前补充10 mg褪黑素可明显降低PSQI、贝克抑郁量表指数和贝克焦虑量表指数。近年有研究[37]通过连续以添加有褪黑素的饮水喂养2～3月龄的雌性昆明小鼠12个月来观察褪黑素对卵巢衰老的保护作用。结果发现，与同年龄段的对照组相比，褪黑素给药组小鼠卵巢中原始和初级卵泡数量有明显的升高，闭锁卵泡的数量有明显的降低，并且卵母细胞中异常纺锤体的出现也有所减少，表明褪黑素可直接作用于卵巢，延缓卵巢衰老引起的卵泡数量丢失和卵母细胞质量的下降。此实验还进一步将卵母细胞用SIRT3抑制剂3-TYP(20 μmol/L)处理，结果发现褪黑素对活性氧的抑制和对纺锤体的保护作用可被SIRT3抑制剂减弱，表明褪黑素延缓卵母细胞体外老化的作用是通过调控昼夜节律相关因子SIRT3的活性而实现的。更有研究[38]观察到持续光照下的雌性小鼠经褪黑素处理后，黄体的维持时间显著延长并接近于正常水平、血清孕酮水平升高，卵巢中昼夜节律基因Clock和Per的表达量也显著上调，表明褪黑素可通过调整持续光照导致的雌性小鼠昼夜节律紊乱，以纠正其动情周期的紊乱，恢复黄体功能而分泌孕酮。

5.2 白藜芦醇

白藜芦醇(Resveratrol，RES)是一种天然多酚化合物，其可通过增加时钟控制基因(SIRT1和NR1D1)的表达参与细胞衰老的过程，近年来其显现出预防和治疗昼夜节律紊乱相关疾病的功能[39-40]。有研究[41]使用RES灌洗POF小鼠，并在体外用RES培养POF卵巢和雌性生殖系干细胞(Female germline stem cells，FGSCs),发现在体内和体外用RES治疗均可显著增加POF小鼠卵巢的重量以及卵泡的数量，同时降低了卵泡的闭锁率，并提高了FGSC的存活率。表明RES可有效改善POF小鼠模型的卵巢功能和提高FGSC的存活能力，可作为保护卵巢功能、治疗POF的早期阶段POI的潜在药物，且这种作用是通过激活昼夜节律相关因子SIRT1而实现的[42]。

5.3 二甲双胍

二甲双胍(Metformin，MET)是目前临床上广泛应用于降糖的药物，近年研究还发现其可延缓生物的衰老过程、延长健康寿命，降低人类衰老相关疾病的发生率[43]。POI是指卵巢功能的提前衰退，二甲双胍是否可延缓卵巢的衰老、延长女性生殖寿命，基于这个疑问有研究[44]探讨了二甲双胍对卵巢的抗衰老作用及内在机制。该研究将27周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON)和二甲双胍组(MET)，CON小鼠随机进行饲喂，MET小鼠饲喂含有100 mg/kg二甲双胍的饲料，为期6个月，根据卵泡数量、发情周期和性激素水平评估卵巢储备功能。结果发现与对照组相比，MET组小鼠的原始卵泡和初级卵泡数量明显增加，血清E2激素水平升高，有规律的发情周期百分比更高。除此之外，还发现MET组SIRT1表达显著增加，而P16、8-OHdG等氧化应激标志物水平降低。这些结果均表明二甲双胍可通过诱导昼夜节律相关因子SIRT1的表达和减轻氧化损伤来延缓卵巢衰老过程。

6 总结与展望

随着社会和科技的发展，轮班、跨时区工作、对手机电脑等人造光源设备的需求不断增加，传统的“日出而作、日落而息”的生活习惯逐渐被“夜深而不寐”所代替，导致人们正常的昼夜节律出现紊乱。综上所述，中西医都对POI与昼夜节律紊乱的关系有很多研究，中医理论对于昼夜节律紊乱与人体生理和女性月经的关系早有一定的认识，调节昼夜节律紊乱为现代中医妇科名家治疗POI提供了新的辨证思路。同时，现代多项研究证实昼夜节律紊乱可通过参与始基卵泡的激活和发育、排卵和性激素的生成以及卵母细胞的衰老而在POI的发生过程中发挥作用。本文还分别列举了褪黑素、白藜芦醇、二甲双胍通过调节昼夜节律紊乱对卵巢功能的保护及对POI的治疗作用，以期为POI的治疗提供新的靶点。目前虽然有很多研究表明调节昼夜节律紊乱的药物具有改善卵巢功能、延缓卵巢衰老的作用，但其中以动物实验为主，缺少临床研究的证实。因此希望今后可以在流行病学、临床研究和动物研究的基础上，将昼夜节律与POI的生理病理关系进一步探究，为POI的预防和治疗提供更明确有效的策略。