固有免疫应答在系统性硬皮病发病机制中的研究进展

王 芳 张建中 杜 娟

北京大学人民医院皮肤科，北京，100044

系统性硬皮病(systemic sclerosis, SSc)是以皮肤及各内脏器官纤维化为特征的自身免疫性皮肤病。该病的发病机制尚未阐明，与血管损伤、免疫失调及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)病理性沉积均密切相关[1]。SSc在皮肤、肢端硬化的同时可出现多种内脏器官纤维化，包括：肺、消化道、心脏、肾脏等，晚期可出现器官危象，临床治疗棘手。免疫失调与SSc发病密切相关，围绕相关免疫细胞及因子的研究近年来有较多进展。最新二代RNA测序研究发现：弥漫型SSc患者早期皮损中M2型巨噬细胞(96%)、M1型巨噬细胞(94%)、CD8+T细胞(65%)、CD4+T细胞(60%)及B细胞(69%)表达均较高，可见固有免疫应答和适应性免疫应答在SSc早期均发挥重要作用；而皮损中巨噬细胞浸润提示患者病程较长、皮肤硬化程度高[2]。固有免疫是人体防御外源及内源性伤害的“第一道”屏障，在激活免疫系统和晚期组织纤维化中均发挥作用[3]。它通过Toll样受体识别内外源性抗原，并由抗原提呈细胞(如树突状细胞等)激活特异性T细胞，建立与适应性免疫应答的联系；同时，单核/巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和树突状细胞等分泌的促炎细胞因子，如IL-4、IL-6、转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)等，可促进局部炎症，诱导ECM病理性沉积[4]。目前国内文献针对该领域关注较少[5]，本文将对固有免疫系统中的细胞及相关蛋白、细胞因子等在SSc发病中的最新研究进展进行综述。

1 单核/巨噬细胞

单核/巨噬细胞是固有免疫系统中重要的调节者，SSc早期出现血管内皮损伤，血液中静息状态的单核细胞M0被募集进入组织，和组织中常驻巨噬细胞Mφ共同引起炎症反应，巨噬细胞分化为经典M1或替代激活M2表型，称为极化[6]。如该部位炎症持续存在，则分泌过多促纤维化细胞因子，引发ECM病理性聚集[7]。研究表明，SSc患者外周血中单核细胞(CD14+)增加，细胞凋亡减少[8]；Soldano等最新发现SSc患者血液循环中的M1(CD80、CD86、TLR2和TLR4标记)/M2(CD163、CD206和CD204标记)双阳性单核/巨噬细胞百分比显著高于健康人[9]；而该组患者肺间质纤维化和肺动脉高压的临床表现更加严重[10]。同时，在患者皮损中增厚的胶原束间、血管和附属器周围均有单核/巨噬细胞浸润。

目前发现，M1型巨噬细胞表达特定的表型标记，包括TLR2、TLR4和共刺激分子CD80和CD86，可被IFN-γ/LPS以及GM-CSF激活，并产生iNOS、IL-12、IL-1β和TNF等炎症介质，促进炎症反应。相反，抗炎型M2型巨噬细胞主要表达甘露糖受体-1(CD206)和巨噬细胞清除剂受体(CD204和CD163)，体外试验发现至少三种亚类的M2型巨噬细胞：M2a(被IL-4和IL-13激活)、M2b(被免疫复合物和LPS激活)和M2c(被IL-10和TGF-β激活)[6]。M2型巨噬细胞与Th2辅助T细胞共同作用，释放VEGF及抗炎细胞因子IL-10等，参与组织修复相关和纤维化过程[11]。

通常认为M1型巨噬细胞促进炎症发生也促进纤维降解，而M2型巨噬细胞缓解炎症活动也促进纤维形成，但在不同的巨噬细胞表型和不同的微环境下其作用并不完全一致，M1/M2型细胞在SSc皮肤纤维化中的作用仍有争议。Higashi-Kuwata等[12]发现患者皮损中M2型细胞增加且与病情严重程度相关，M2型细胞可产生大量TGFβ-1促进成纤维细胞转化，它还可增加组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteases, TIMP-1)分泌，通过抑制金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)活性而减少细胞外基质降解。M2型细胞可被IL-4激活，在创伤小鼠模型中可通过调节IL-4产生促纤维化作用，缺乏IL-4Ra受体或者M2型巨噬细胞相关基因Retnlα(resistin-like alpha)的小鼠在皮肤创伤修复过程中胶原蛋白产生减少[13]。最新发现M2型巨噬细胞分泌大量IL-4和TGFβ-1，并且选择性通过IL-4/JAK1/STAT6通路促进成纤维细胞活化[14]。

巨噬细胞极化可受多种信号通路调节。Wnt/β-catenin通路可促进巨噬细胞活化并向M2型表型转化，促进纤维化进程[15]；而β-catenin的外用抑制剂C-82阻断该通路，则可以有效改善皮肤纤维化。JAK/STAT通路也可激活巨噬细胞，当该通路受体与IL-4结合可促使胞内STAT6磷酸化，导致巨噬细胞向M2型转化，加速纤维化过程[16]。TGF-β/Smad通路激活也可促使巨噬细胞向促纤维化表型转化，而巨噬细胞自分泌TGF-β可以加速并放大纤维化效应。鉴于巨噬细胞在SSc中的发病作用，调节巨噬细胞活化的信号通路将可能成为疾病治疗中的关键靶点。

2 肥大细胞

肥大细胞(mast cell)是一种富含致密颗粒的免疫细胞，在防止寄生虫感染以及过敏性疾病中起关键作用。临床发现，SSc患者硬化的皮肤中肥大细胞密度显著增加，且与患者病程、皮肤的改良Rodnan评分以及血清抗拓扑异构酶I抗体正相关，提示该炎症细胞参与疾病早期炎症[17]。同时，肥大细胞在原发性心脏、肾脏和肺部纤维化疾病中均有浸润[18]。研究发现，肥大细胞的囊泡是促炎因子(如TNF-α、IL-17等)和促纤维化分子(如IL-4、IL-10及TGF-β等)的储存库，可通过脱颗粒释放或直接与成纤维细胞接触传递炎症因子[19]。最新发现，角质形成细胞中由Snail通路介导的纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor type 1, PAI1)产生，进而诱导肥大细胞进入真皮，促进成纤维细胞黏附和纤维化[20]。与之相反，有实验证明肥大细胞为主释放的组胺可与成纤维细胞膜的H1受体结合，通过抑制TGF-β1/Smad2通路，抑制成纤维细胞分化[21]。整体而言，肥大细胞脱颗粒释放的细胞因子TGF-β仍是其促纤维化的主要作用。

3 中性粒细胞

中性粒细胞也是固有免疫中的重要一员，可保护机体免受细菌及其他内源性危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)等破坏，通过吞噬作用、呼吸链、释放活性氧(reactive oxygen species, ROS)及中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)等发挥作用。在创伤或病原体入侵部位，中性粒细胞可释放促炎细胞因子：IL-1α，IL-1β，肿瘤坏死因子(TNF)及IL-6增强防御[22]，“警报解除”后，中性粒细胞凋亡并被巨噬细胞清除，完成使命。目前，中性粒细胞在慢性炎症及SSc纤维化中的作用并未完全阐明。中性粒细胞是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要来源，当局部聚集过量的ROS可损伤血管内皮[23]。进一步研究发现：当血管内皮持续损伤并激活聚集的血小板时，可释放大量SSc微粒(SSc-microparticles)，促进中性粒细胞自噬，蛋白水解增加，同时释放NETs发挥促炎作用[24]。NETs在肺和皮肤纤维化标本中与α-SMA阳性的肌成纤维细胞非常近，提示可能存在由中性粒细胞介导的新的纤维化机制[25]。然而另一研究发现，提取SSc患者血浆和中性粒细胞中的外来体(exosome)-细胞衍生的囊泡，内含各种DNA、RNA和蛋白质，该外来体可抑制人真皮血管内皮细胞的增殖和迁移[26]。由此，中性粒细胞在慢性炎症中是否存在双向调节作用仍值得研究。

4 树突状细胞

树突状细胞包括传统树突状细胞和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)。pDC是一种特殊类型的细胞，当被激活时可以释放大量干扰素(interferon, IFN)。SSc患者皮肤及肺部长期有pDC浸润，通过产生CXCL4，激活TLR8受体，释放INF-α促进纤维化；在SSc小鼠模型中敲除pDC后可逆转皮肤纤维化[27]。另一研究也发现在博来霉素诱导的硬皮病小鼠中敲除pDC后，其临床评分、肺部病理评分、皮肤厚度和胶原蛋白含量均得到改善；pDC敲除的小鼠肺部改善与趋化因子、树突状细胞分化、促炎和纤维化相关的基因表达下调有关。该研究同时发现肺组织中浸润B细胞、T细胞减少，可见pDC在SSc持续的免疫异常中发挥作用[28]。pDC如何被调控？已证实在SSc小鼠中TGF-β可趋化pDC、Th细胞及浆细胞等进入皮肤，而TGF-β拮抗剂可明显抑制该过程[29]。最新发现SSc患者皮损pDC中的微小RNA-618(miRNA-618)表达显著升高，进而增加INF分泌，成为SSc样pDC表型[30]。此外，用DNA拓扑异构酶I(TopoI)的肽段可诱导DC产生抗TopoI抗体，增加IL-17A和CXCL4促炎因子，导致皮肤和肺部的持续纤维化[31]，但pDC在抗原提呈、如何与T细胞及其他免疫细胞相互作用等环节仍需更多研究。

5 Toll样受体及其配体

Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)是固有免疫中识别内外源性危险信号的一类重要蛋白分子，也是连接其与适应性免疫的“桥梁”。目前人体中发现10种，在不同免疫细胞或成纤维细胞的细胞膜或胞吞囊泡中表达，通过识别病原性配体激活胞内信号传导通路。其配体包括外源性病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)和DAMPs，DAMPs通常为细胞内源性分子，当外伤或应激状态下可释放，触发免疫应答，包括内源性Ca2+、ATP、自身核酸、热休克蛋白、ECM片段及损伤的线粒体DNA等[32]。TLRs及其配体在感染、肿瘤、炎症性疾病和自身免疫病等中均发挥重要作用，最近证实SSc患者中TLRs表达水平升高[33]。

在人体中，TLR1、2、4、5、6和10为细胞膜蛋白，在巨噬细胞、T细胞、树突状细胞或成纤维细胞等中有表达。目前，TLR4及其配体在SSc中的作用研究最为深入。SSc患者皮肤活检中TLR4、胞外附属的髓样分化蛋白和CD14均明显升高[34]。基因敲除TLR4后在博来霉素诱导C57BL/6小鼠和TLR4-/-TSK+硬皮小鼠(the tight skin mouse, TSK)模型中均免于纤维化诱导[35]。组织损伤时，内源性DAMPs配体可被TLR4识别，近年来发现一些新的DAMPs及其作用方式。SSc患者皮肤和血清中的腱生蛋白C(tenascin-C)增加，该细胞外基质蛋白的FBG区域可与巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞上的TLR4受体结合，激活胞内MyD88介导的信号通路，促进α-SMA和胶原蛋白生成[36]。同样，外伤后暴露的纤连蛋白EDA区域在SSc患者皮肤和血清中也明显增加，通过激活并释放TGF-β1，进而促进成纤维细胞分化及分泌ECM[37]。近期体外研究证实，细胞外线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)可促使成纤维细胞表达α-SMA，成为一种新的TLRs配体[38]。此外，TLR2在SSc患者成纤维细胞中表达也显著升高，通过识别血清淀粉样蛋白A，促使胞内促纤维化细胞因子IL-6释放[39]。

细胞内TLRs包括TLR3、7、8和9，这组蛋白可敏感监测病毒来源的核酸片段。TLR3经IFN1刺激后分泌增加，进一步增加IL-6和单核细胞趋化蛋白-1表达，招募更多巨噬细胞进入组织中[40]，而后者是固有免疫中重要的调节者。TLR7/8是单链RNA(ssRNA)的受体，被激活后通过增加基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)的分泌，进而抑制细胞外基质降解，促进皮肤纤维化。TLR8还可通过增加树突状细胞分泌的CXCL4诱导纤维化[27]。TLR9在SSc皮肤样本的肌成纤维细胞中表达也升高，可识别双链DNA(dsDNA)的非甲基化CpG序列，通过MyD88通路促进TGF-β大量分泌，促进成纤维细胞分化发挥作用[41]。随着TLRs在SSc发病机制中的研究，目前针对阻断DAMPs配体、TLRs受体(TLR2、4、7、8等)及下游信号通路的小分子靶向药物成为治疗本病的热点之一[33]。

6 相关细胞因子

SSc炎症中有很多细胞因子参与，在皮肤、肺部及血清中均有不同程度升高，目前针对IL-4、IL-6 和TGF-β的研究较为深入。研究发现IL-4可促进成纤维细胞合成胶原蛋白及其他ECM，IL-4抗体可抑制TSK硬皮小鼠纤维化；同样的，敲除TSK小鼠的IL-4受体也可见纤维化减轻[42]。TGF-β是成纤维细胞分化为肌成纤维细胞中最重要的细胞因子，它可以激活TGF-β/Smad通路，促进胶原蛋白I、III型、纤连蛋白等ECM蛋白合成；同时它可以促进成纤维细胞自分泌TGF-β，放大纤维化过程[43]。TGF-β还可通过MAPK、JNK和ERK1等非Smad通路调节炎症反应[44]。IL-6在SSc早期和晚期均发挥作用，IL-6敲除的小鼠纤维化作用明显减弱；IL-6及其受体可通过IL-6/STAT3通路促进胶原蛋白分泌[44]。目前针对IL-6受体的托珠单抗(tocilizumab)已发现可有效改善SSc患者皮肤硬化，有望成为新的治疗药物[45]。

7 总结

SSc发病机制复杂，大量证据表明固有免疫对于启动免疫系统至关重要，多种细胞及分子参与了病理过程中血管损伤、免疫细胞激活及纤维化的过程。其中，TLRs及其配体、巨噬细胞发挥重要作用，其与适应性免疫的T细胞、B细胞相互作用，并有其他细胞因子、趋化因子等参与，最终调节成纤维细胞分化、及ECM合成及降解的平衡。未来对于各类固有免疫细胞的病理学作用的精细研究及针对特定细胞亚群或分子研制相应的靶点研究，将有助于SSc临床评估及新药物研发。