血管内皮糖萼降解与体外循环关系的研究进展

叶明棠，丁培成，莫绪明

血管内皮糖萼（endothelial glycocalyx，eGC）是内皮细胞管腔表面的凝胶状层，由膜结合蛋白聚糖、糖蛋白、胺聚糖和黏附的血浆蛋白组成，它具有血管稳态所必需的多种功能：调节血管通透性和微血管张力、抑制微血管血栓形成以及调节白细胞在内皮细胞上的黏附等［1－2］。 在体外循环（extracorporeal circulation， ECC）期间，由于病理生理损伤的共同效应，糖萼将发生降解，伴随ECC 中预充液等医源性效应，潜在地加重了这种损伤。 糖萼的降解也被认为是ECC 中导致患者水肿及微循环障碍的原因［3－4］。 考虑到糖萼降解的病理生理学意义，ECC时流入血液的糖萼降解产物可作为临床相关生物标志物。 本文拟就eGC 降解与ECC 关系的研究进展做一综述。

1 eGC 的组成与作用

1.1 eGC 组成与结构 eGC 也称多糖包被，是由Luft［5］首先于1966 年在电镜下直接观察到的一层20 nm 左右的淡蓝色荧光物质。 随着组织固定、染色和成像技术的进步，人们对eGC 的组成和结构有了更加深入的了解，发现糖萼层主要由蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）、膜糖蛋白及血浆蛋白组成，其中PGs 和GAG是其主要组成部分。

PGs 由锚定在内皮细胞顶膜上的核心蛋白和几条GAG 链共价连接到内皮细胞上，包括多配体聚糖－1（Syndecan－1）、 磷脂酰肌醇聚糖及唾液酸。 其中Syndecan－1 作为－核心蛋白通过跨膜结构域依附在血管内皮上，并与硫酸乙酰肝素（heparin sulfate，HS）和硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）相连接，这种结构参与了血管内皮剪切力的转导［6］；而磷脂酰肌醇聚糖则是通过糖基化磷脂酰肌醇锚定在内皮细胞上，同时与HS 相连，构成了糖萼的“骨架”。

GAG 按照单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置可分为5 个主要类别：HS（GAG的主要成分，占糖链的50%以上）、透明质酸（hyalu⁃ronic acid，HA）、CS、硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）、硫酸角质素（keratan sulfate，KS）［7］。 其中含硫成分带负电荷，使静电与血浆蛋白相互作用。 相比之下，HA 是一种大型的线性分子，它不与蛋白多糖结合，而是与细胞膜CD44 相互作用。 HA 也不同于其他GAG，因为它不是硫酸盐，因此是不带电的。然而，HA 可以与其他硫酸化的GAG 形成复合物，使其能够固水并稳定eGC 的凝胶状结构［7］。

1.2 eGC 的作用 eGC 在生理条件下主要起着血管通透性的屏障、机械转导、抗凝血和抗黏附作用。在所有动脉或静脉血管中，带负电的乙二醇（ethyl⁃ene glycol，EG）都参与内皮屏障的选择性渗透，这种网状结构限制了带负电荷和／或大于70 kDa 的分子的跨血管运动，阻止蛋白质和大分子从血液扩散到间隙并通过建立一个跨血管白蛋白梯度。 此外，eGC 有着机械转导作用，通过感应流体剪切力，并将这些力传递给内皮细胞，从而启动一氧化氮（nitric oxide，NO）介导的血管舒张。 同时，eGC 在内皮细胞表面提供抗凝血和抗黏附作用，它可以保护内皮细胞免受氧化应激。

在ECC 期间，糖链部分被降解，不能发挥其正常功能，这将导致血管通透性增强、组织水肿、白细胞黏附增强、血小板聚集和血管舒张失调。 因此，推测降解导致eGC 功能障碍，恢复eGC 的正常结构是潜在的治疗目标。

2 ECC 引起eGC 降解的发生机制

2.1 ECC 引起 eGC 降解的研究 在 ECC 期间，由于病理生理损伤的共同效应，eGC 发生降解。 降解的血管内皮层变得更薄更稀疏，允许血浆蛋白（例如白蛋白）和液体穿过血管壁，导致组织水肿形成［3］。 这种降解将 eGC 成分（如 syndecan－1、HS、HA、CS）释放到血浆中，从而可以从血浆中测得eGC的降解成分来判断eGC 是否发生降解。 许多临床研究表明，ECC 会使患者的 eGC 层厚度降低［3，8］。Nussbaum 等人［9］发现经 ECC 手术后，灌注边界区域显着增加，表明与术前值相比，术后早期eGC 层厚度减少。

2.2 炎症诱导的因子参与eGC 降解的研究 许多临床研究已经证明了炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）－α、白细胞介素（inter⁃leukin，IL）－1β、IL－6、IL－8 和 IL－10 与 eGC 降解生物标志物之间的联系［10－11］。 其中，在接受 ECC 下心脏手术患者中，炎性介质TNF－α 和IL－1 与启动炎性级联过程相关，促炎细胞因子IL－6 和IL－8 以及抗炎细胞因子IL－10 的炎症与eGC 降解（血浆syndecan－1 浓度）相关。 Schmidt 等人通过使用 TNF－α 受体 1 缺陷小鼠，证明了 TNF－α 信号是 eGC 降解的必要条件。 这种降解是由乙酰肝素酶激活介导的，因为肺微血管内皮细胞的TNF－α 增加了乙酰肝素酶翻译后激活和HS 降解的活性。 CB Henry 等人通过对仓鼠的试验表明：①eGC 大分子渗透增加可能是由TNF－α 处理后的滚动或黏附白细胞破坏所致。 TNF－α 可能激活了白细胞释放出可以降解eGC 成分的自由基和／或蛋白酶。 TNF－α 还可能激活内皮衍生的自由基或表面结合的蛋白酶或磷脂酶，从而从eGC 中释放出癸二聚糖或甘氨酸聚糖。一旦激活，白细胞就会在其微绒毛的尖端表达选择素，并被其在内皮上的配体捕获。 这将启动黏附的缓慢滚动阶段，并促进随后的整联蛋白和Ig 型黏附分子的牢固黏附和外渗。 ②提睾肌中的局部细胞因子池激活了通过的白细胞，然后释放破坏eGC 的因子。 ③TNF－α 直接刺激内皮细胞，使其脱落 eGC 的某些成分，释放自由基，或激活降解它的表面结合蛋白酶或磷脂酶。 内皮衍生的金属蛋白酶是由TNF－α 上调和在内皮形态。 Yang 等［12］报道了基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）15（ADAM15）在体内和体外作为CD44 胞外域的一种酶。 他们发现在敲低MMP15 的内皮细胞中，脂多糖处理诱导的CD44 的脱落大大减少。

近来，血管生成素（angiogenin，Ang）－2 被研究为糖萼降解的关键介质。 Ang－2 是内皮细胞在炎症刺激下分泌的蛋白质。 它作为Ang－1 的内在拮抗剂，阻止通常由Ang－1 激活其受体Tie2 诱导的抗炎信号。 Lukasz 等［13］人发现，使用人脐静脉内皮细胞系和小鼠，Ang－2 治疗引起体内和体外eGC 的快速降解。

虽然炎症刺激可以引发eGC 降解，但eGC 的完整性也可以反馈到炎症过程本身。 例如HS 和syn⁃decan－1 与细胞表面的趋化因子结合，在降解过程中，释放的这些趋化因子可能通过促进额外的中性粒细胞募集而放大炎症。

2.3 过度液体灌注对eGC 降解的影响 数据表明，过度液体灌注可能导致eGC 降解。 高容量血症与ECC 中eGC 降解增加有关。 几项临床前和临床研究表明，高容量血症诱导心房释放心房钠尿肽（atri⁃al natriuretic peptide，ANP）以响应机械壁应力，这反过来可能降解 eGC［14］。 Chappell 等人［15］进行了一项试点研究，选择心肺功能良好的心脏外科患者。他们比较了用6%羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）130／0.4（20 ml／kg；n ＝9）和急性等容血液稀释（n ＝9），其中抽取的血液量同时被等量的HES 130／0.4 替代。 容积负荷组平均 ANP 水平显著升高，而等容性组的平均ANP 水平没有显著增加。 体积负荷也显著增加了syndecan－1 和HA 的平均水平，等容组三种生物标志物的平均水平均无显著升高。

但是，ANP 和eGC 脱落之间的因果关系仍未得到证实。 Hahn 等［16］表明容积负荷仅适度增加血浆NAP 浓度。 此外，还没有证实 ANP 引起 eGC 脱落的机制。 因此需要进一步研究。

3 检测eGC 降解的方法

3.1 多糖包被降解的直接床旁成像 正交相谱或侧流暗场（sidestram dark field， SDF）成像是活体的显微镜成像技术，能够评估床旁舌下微血管的厚度［17］。 灌注边界区域是一个 SDF 测量的参数，SDF测量的参数与多糖包层厚度成反比，已被提出可以代表多糖包层厚度。 但对于舌下微循环作为临床相关器官损伤标志物的可靠性和相关性仍存在质疑。因此，还需要进一步的研究。

3.2 循环生物标志物定量化检测

3.2.1 Syndecan－1 ECC 会导致内皮 eGC 的脱落。而Syndecan－1 是衡量内皮eGC 脱落的主要指标。Kim 等［18］检测行ECC 下心脏瓣膜手术后高水平的Syndecan－1 和严重急性肾损伤关系，发现术前血清syndecan－1 的中位浓度为 51（34，88）μg／L，ECC 后增加至 241（140，423）μg／L（P＜0.001）。 Abou－Ar⁃ab 等［19］分别在手术前、手术后立即入 ICU 和术后第一天对在ECC 下心脏手术的患者采集血样检测yndecan－1 值，心脏手术后 syndecan－1 水平显著升高。 术后水平高于术前水平（ICU 入院时P＝0.001，手术后立即入 ICU 时P＝0.0001）

3.2.2 HS HS 在 ECC 中也有升高的报道。 Wu等［4］检测30 例行ECC 心脏手术患者术前静息状态、胸骨劈开后、主动脉夹闭后、主动脉开放前5 min、ECC 术后 1 h、ECC 术后 4 h、24 h、48 h 时 syn⁃decan－1、HS 浓度及 HA 浓度。 发现 HS 浓度在 ECC后 4 h 时达到峰值（3.1 倍，P＜0.01），并在 ECC 48 h后持续升高。

3.2.3 HA 在生理条件下，HA 有助于维持 eGC 的结构。 在体外和体内，GAG 降解酶用于评价eGC 的厚度，但这些实验的结果变化很大，可能是由于所研究的血管的性质和处理条件（酶的性质、暴露的数量和时间）所导致。 例如，将牛睾丸中的细菌肝素酶、软骨蛋白酶和透明质酸酶注射到大鼠肠系膜后毛细血管小静脉，分别导致EG 厚度下降43%、34%

和26%（用活体显微镜观察）。 电镜观察到，用牛睾丸透明质酸酶处理的大鼠心肌毛细血管EG 厚度减少了58%，而用双光子激光扫描显微镜观察，同样处理的小鼠，颈动脉EG 厚度减少25%。 然而，内源性透明质酸酶或血凝素合成酶在EG 血凝素稳态中的作用尚未被证实。

4 抑制ECC 导致eGC 降解的治疗进展

4.1 胶体保护eGC 完整性的研究 白蛋白被认为对eGC 具有保护作用。 白蛋白携带红细胞来源的鞘氨醇－1－磷酸（sphingominol－1－phosphate， S1P）到内皮，在那里白蛋白通过抑制MMP 活性介导eGC的恢复［20－21］。 Jacob 等［22］人报道了白蛋白在豚鼠心脏缺血模型中的保护作用。 与未经白蛋白处理的模型相比，经白蛋白处理的模型在冠状动脉流出物中的合成syndecan－1 和HS 的平均水平显著降低。

新鲜冰冻血浆（fresh frozen plasma，FFP）对 eGC降解有保护作用。 Kozar 等人［23］证明，与对照组和乳酸林格液组相比，FFP 抑制失血性休克大鼠的eGC 降解。 他们还检测了从失血性休克大鼠肺组织中提取的syndecan－1 基因的水平。 与对照组相比，失血性休克组syndecan－1 平均mRNA 水平显著降低（1.39±0.22）。

4.2 抑制ECC 中eGC 降解的应用研究

4.2.1 S1P S1P 是一种鞘磷脂，通过抑制 syndecan－1 的脱落，有助于提高多糖包被的完整性。 S1P 激活S1P1受体，而S1P1受体的激活减弱了MMPs 的活性，导致 syndecan－1 外域脱落［21］。

4.2.2 NO NO 是血管细胞的重要信号分子，低水平的 NO 可以防止氧化细胞损伤。 Bruegger 等［24］发现在没有酶促反应破坏eGC 时，再灌注期间施用NO 对eGC 具有保护作用。

4.2.3 蛋白酶抑制剂 凝血酶等蛋白酶已被证实参与多配体聚糖胞外域的切割，抑制蛋白酶活性可起到保护eGC 的作用，所以蛋白酶抑制剂的治疗用途具有可能性。 Boels 等［25］研究表明，通过抑制单核细胞趋化蛋白－1 可影响巨噬细胞组织蛋白酶L分泌，从而减少糖萼降解酶乙酰肝素酶的激活。 另有研究表明，抗凝血酶可防止TNF－α 和心脏缺血再灌注引起的eGC 的脱落。

4.2.4 TNF－α 信号抑制剂 TNF－α 仅是炎症发展的关键介质之一，临床使用TNF－α 信号传导抑制剂可显著减少内毒素引起的eGC 成分脱落、凝血激活和功能性血管功能紊乱。

4.2.5 糖皮质激素 糖皮质激素通过介导内皮一氧化氮合酶的非转录激活表现出对缺血－再灌注损伤的保护作用。 除此之外，它还可以通过阻止各种趋化因子和细胞因子的合成来防止炎症细胞从循环系统迁移到组织。 皮质类固醇可增加全身血管阻力，并增强儿茶酚胺和血管紧张素Ⅱ的血管收缩反应。 潜在的机制可能涉及下调产生血管扩张剂（如NO 和前列环素）的酶的表达和活性。 此外，已知糖皮质激素可作用于细胞间连接，以某种方式实现了大分子的跨内皮液流量和细胞旁通透性的降低，因此通常用于预防组织间水肿和肿胀。

4.2.6 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth fac⁃tors，FGF） FGF 是 eGC 生理修复的介质［26］。 它被eGC 降解产生的HS 循环片段快速激活，并与FGF受体结合，后者传导信号激活eGC 修复分子，如HS合成的酶反应蛋白－1［27］。

5 结论

eGC 降解作为ECC 病理生理学的一个重要部分，正在得到研究者的重视。 虽然降解的机制尚未完全阐明，但血浆和尿液中eGC 降解成分水平的升高可作为行ECC 手术患儿微循环障碍及水肿发生的生物标志物。 进一步的研究来确定如何在ECC期间防止或修复eGC 降解的研究仍需要加强。