微塑料对黑麦草吸收和累积水体中环丙沙星的影响

单 宁， 祖木热提·艾比布， 米丽班·霍加艾合买提， 努扎艾提·艾比布*

1.新疆师范大学化学化工学院， 新疆 乌鲁木齐 830054

2.昌吉职业技术学院， 新疆 昌吉 831100

塑料制品被广泛应用于日常生活中，在带来便利的同时也引起了一系列环境问题. 塑料垃圾经过长时间的风化、裂解可以形成粒径很小的塑料颗粒，2004年Thompson等[1]首次提出了“微塑料”(microplastics， MPs)的概念. 一般粒径小于5 mm的塑料颗粒被称为微塑料[2]. 世界各地的海洋、沉积物、河道及土壤等环境中均已检测出微塑料的存在[3-8]. 近年来，国内外开展的微塑料对水生生物的生态毒理性研究表明，水生生物摄取微塑料后会产生氧化应激、减少摄食、降低存活率和生殖抑制等现象[9]. 有研究表明，微塑料会抑制藻类的光合作用[10-11]，也会对黑麦草体内叶绿素b有明显的抑制作用[12]. 与此同时，微塑料比表面积大，较容易富集环境污染物. 已有研究[13-14]表明，微塑料可作有机氯农药、多氯联苯和多环芳烃等疏水性有机污染物的载体. LI等[15]研究发现，水环境中的聚酰胺塑料颗粒可作为抗生素的载体.

抗生素作为一种新型环境污染物也是当前的研究热点之一，已有研究者在土壤及水环境中检测出不同种类的抗生素[16-17]. 相关研究发现，抗生素对植物生长表现出“低促高抑”的现象，同时会导致微生物产生抗生素耐药基因[18-19]. 作为环境中频繁出现的两种新兴污染物，微塑料很可能作为抗生素类污染物的载体，影响其环境行为和毒性效应. 研究[20]表明，吸附有磺胺甲恶唑的微塑料会导致白符跳虫内脏产生抗生素耐药基因，同时也会影响其肠道内微生物群落的种类.

迄今为止，微塑料与抗生素复合污染物的研究主要集中于吸附机制和特性方面，微塑料对抗生素的生物有效性、植物体内吸收积累及生态毒理作用的影响尚不明确. 黑麦草作为一年或多年生的优质牧草，有根系发达、生物量大、在逆境生存能力极强等优点[21-22]，可作为复合人工湿地栽培植物用于净化污水. 因此，该研究以黑麦草为受试植物，以环丙沙星和聚苯乙烯微塑料为研究对象，探究微塑料对植物去除抗生素效率的影响、微塑料-抗生素复合污染对植物的生理毒性和微塑料对黑麦草体内积累和去除水中环丙沙星的影响，以期为植物修复微塑料-环丙沙星复合污染物提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑麦草种子购自邳州市奇缘花卉种植园；聚苯乙烯微塑料(500 nm)购自南京捷纳思新材料有限公司；环丙沙星(纯度98%)购自上海麦克林生化科技有限公司；95%乙醇购自阿拉丁试剂有限公司，甲酸(纯度88%)购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)购自美国西格玛奥德里奇有限公司，乙腈(色谱纯)购自阿拉丁试剂有限公司.

1.2 植物的培养

将黑麦草种子在15%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，用去离子水冲洗3次后均匀撒在提前消毒过的托盘中的医用纱布上，用蒸馏水浸泡并放入25 ℃的培养箱，在黑暗条件下发芽3 d. 将发芽的黑麦草从培养箱内移出来在室温(23±2)℃下继续培养. 待黑麦草长至约12 cm时，将其移到150 mL含有12 浓度Hoagland营养液的锥形瓶中继续培养.

环丙沙星作为第二代氟喹诺酮类抗生素，在水体中检出浓度达到几百ngL，在生产污水中可达30 mgL[23]. 试验共设置8个处理组: ①不添加污染物的空白对照，记为T1；②添加50.0 mgL MPs，记为T2；③添加0.1 mgL CIP，记为T3；④添加50.0 mgL MPs和0.1 mgL CIP，记为T4；⑤添加1.0 mgL CIP，记为T5；⑥添加50.0 mgL MPs和1.0 mgL CIP，记为T6；⑦添加2.0 mgL CIP，记为T7；⑧添加50.0 mgL MPs和2.0 mgL CIP，记为T8.

表1 12浓度Hoagland营养液配方

Table 1 The concentration of 12 Hoagland nutrient solution

表1 12浓度Hoagland营养液配方

试剂化学式浓度∕(g∕L)Ca(NO3)2·4H2O94.500KNO360.700NH4H2PO411.500MgSO4·7H2O49.300MnSO4·H2O0.082ZnSO4·7H2O0.011CuSO4·5H2O0.011Na2MoO4·2H2O0.030H3BO30.143FeSO4·7H2O1.390Na2·EDTA1.865

1.3 测定方法

1.3.1生物量测定

在试验开始的第0天和第16天，分别测定黑麦草的鲜质量、根长和叶长，计算所得差值分别为黑麦草的鲜质量净增长量、根长净增长量和叶长净增长量，比较培养周期内黑麦草在微塑料、CIP和MPs-CIP复合污染作用下生物量净增长量之间的差异性.

1.3.2叶绿素含量测定

叶绿素含量参考《植物生理生化实验原理和技术》中的测定方法[24]，用95%乙醇提取黑麦草叶片中的叶绿素，用双光束紫外可见分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司)测定萃取液的吸光度，计算叶绿素a、b的含量.

1.3.3环丙沙星提取

底物中环丙沙星含量测定：在试验开始的第0天和第16天分别用玻璃棒将水样搅匀后取2.0 mL，过0.45 μm的过滤膜，4 ℃保存，待测.

黑麦草体内环丙沙星的提取：分别剪去等量鲜质量(0.5 g)的植物新鲜样品，用液氮迅速冷冻，并将样品碾碎成粉末. 将粉末状植物样品与8.0 mL萃取液(0.5%甲酸与甲醇的体积比为1∶1)混匀，剧烈振荡10 min后置于振荡器摇动24 h，离心收集上清液，旋转蒸发至2 mL左右，再用氮气吹至干燥，最后溶解于1 mL的甲醇，过0.22 μm的有机滤膜得滤液，4 ℃下保存，待测[25].

营养液和从黑麦草体内提取的CIP均用高效液相色谱法(Agilent 1260，安捷伦科技有限公司，美国)进行定量分析. 测试时参考Panja等[26]的方法，部分条件做出调整，具体测试条件：选用Agilent ZORBAX C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相是体积比为20∶80的乙腈和甲酸(0.1%)混合液，进样体积为20 μL，流速为0.8 mLmin，柱温30 ℃，检测波长278 nm，柱压 8 800 kPa左右.

1.4 数据处理

数据均用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 20软件进行整理和分析，试验数据以平均值±标准方差(SD)表示，运用SPSS Statistics 20软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)对不同污染物处理对黑麦草生物量、叶绿素含量及其吸收累积差异性进行统计分析，并进行LSD显著性检验，采用Origin 2019软件进行绘图.

2 结果与讨论

2.1 微塑料对黑麦草吸收去除环丙沙星的影响

黑麦草生物量大、根系发达，具有修复受污染土壤和水体的潜力[27-28]. 如图1所示，黑麦草具有吸收去除水溶液中CIP的能力，且微塑料的存在会对黑麦草吸收CIP具有一定的促进作用，但微塑料对黑麦草吸收CIP的促进作用会随着CIP浓度的增加而减少. 当CIP浓度为0.1 mgL时，投加50.0 mgL的微塑料后，黑麦草对CIP的吸收去除率达到100%. 与单一CIP处理组相比，投加微塑料后，黑麦草对0.1、1.0和2.0 mgL的CIP吸收去除能力分别增加了45.0%、5.0%、3.1%，这可能与底物中微塑料对CIP的吸附量有关. 不同处理组之间黑麦草对CIP的去除率存在显著差异(见图1)，黑麦草对0.1 mgL CIP和50.0 mgL MPs-0.1 mgL CIP处理组中CIP的去除率存在显著差异(P<0.05)，但对高浓度CIP(1.0、2.0 mgL)处理组之间差异并不显著(P>0.05). 由此可见，当CIP浓度较低时，微塑料可以促进黑麦草对底物中CIP的去除，但对黑麦草去除高浓度的CIP并无显著影响. 由于聚苯乙烯微塑料表面存在—COOH基团，可形成氢键，并带负电荷，因此可通过静电引力、π-π作用将CIP吸附其表面[29-30]. 微塑料可作为CIP的载体将更多的CIP带入植物体内，从而促进黑麦草对CIP的吸收及体内的积累. SUN等[31]的研究也证实了植物能吸收并在体内转运环境中小粒径的微塑料. Hodson等[32]研究表明，微塑料可以作为接触载体来提高锌的生物有效性.

注： 不同字母表示处理组之间在0.05水平上存在显著性差异(n=5).

2.2 微塑料对黑麦草体内积累环丙沙星的影响

试验结果表明，不同处理组的CIP均能被黑麦草的根系吸收并被转运至地上部(见图2). 随着底物中CIP浓度的增加，黑麦草根部和叶片内CIP的积累量总体呈逐渐增加的趋势；与单一CIP处理组相比，在MPs-CIP复合污染处理组中黑麦草体内CIP的积累量呈显著增加趋势. 由图2可见，相同CIP浓度下，底物中共存的微塑料对根部CIP的积累并无显著影响(P>0.05)，但微塑料对叶片内CIP的积累存在显著促进作用(P<0.05). 这可能是因为黑麦草在根部吸收养分和CIP的同时也吸收了部分表面吸附CIP的微塑料，从而增加了其体内CIP的含量. 已有研究[33]表明，微塑料可以吸附持久性有机污染物(POPs)，并促进这些污染物在生物体内富集. 另外，在单一CIP处理组中，黑麦草根部CIP的积累量均大于叶片，但相同浓度CIP与50.0 mgL微塑料共存时，微塑料会促进根部积累的CIP向地上部转运，最终叶片中CIP含量大于根部. 当CIP浓度为0.1 mgL时，与单一CIP处理组相比，投加50.0 mgL的微塑料后，黑麦草根部CIP的积累量降低了44.0%，而叶片中CIP的积累量则增加了2.9倍(P<0.05)；当CIP浓度为2.0 mgL时，投加MPs后黑麦草根部CIP的积累量降低了21.2%，而叶片中CIP的积累量增加了3.0倍(P<0.05). 李连祯等[34]研究发现，0.2 μm的聚苯乙烯微球可以被生菜(Lactucasativa)吸收，并从根部迁移到地上部进而在茎叶中积累. 因此，进入黑麦草体内的微塑料在向地上部迁移的同时，会将更多的CIP转移到叶片，从而促进CIP在地上部积累.

注： 不同字母表示处理组之间在0.05水平存在显著性差异(n=3).

2.3 微塑料-环丙沙星复合污染对黑麦草生物量的影响

如图3所示，单一CIP处理组和MPs-CIP复合污染处理组黑麦草生物量净增长量随着CIP浓度的增加而逐渐减小，其中，MPs-CIP复合污染处理组对生物量净增长量的抑制作用更为显著. 与单独投加0.1 mgL、2.0 mgL CIP的处理组相比，50.0 mgL MPs-0.1 mgL CIP、50.0 mgL MPs-2.0 mgL CIP复合污染处理组黑麦草的鲜质量和根长净增长量分别降低了16.5%、55.5%和53.7%、79.6%(P<0.05)，说明微塑料的存在加重了CIP对黑麦草生长的抑制作用. 单一微塑料的存在也对黑麦草根部生长和鲜质量有显著抑制作用(见图3). 与空白对照相比，单一微塑料处理组的黑麦草根部和鲜质量净增长量分别降低了49.3%和33.8%(P<0.05). 这可能是因为微塑料对黑麦草光合系统产生了损害，阻碍了蛋白质的合成，进而抑制植物生长[35]. Besseling等[36]研究发现纳米微塑料会显著抑制藻类生长，李贞霞等[37]研究发现18 μm的聚氯乙烯微塑料明显抑制了黄瓜(CucumissativusL.)根系的生长. 由此可见，MPs-CIP复合污染处理黑麦草时，微塑料的存在加重了CIP对黑麦草生长的抑制作用. 李瑞杰等[38]研究发现，0.2 μm的聚苯乙烯塑料微球能被禾本科作物转运至木质部，并向地上部转移. JIANG等[39]报道了微塑料通过影响植物营养元素的运输，进一步对蚕豆(Viciafaba)的生长产生抑制作用. 由此可见，聚苯乙烯微塑料吸附CIP后部分CIP在根部积累，并抑制根系的生长发育，从而影响根系对营养物质的吸收，减少营养物质向地上部的运输；同时，转运至叶片中的MPs-CIP复合污染也对叶片产生一定的毒害作用，从而导致黑麦草地上部生物量净增长量的降低.

注： 不同字母表示各处理组在0.05水平存在显著性差异 (n=5).

2.4 微塑料-环丙沙星复合污染对黑麦草叶片中叶绿素的影响

叶绿素是植物光合作用的重要活性物质[40]，其含量与植物光合作用速率呈正相关. 在试验后期，单一CIP处理组和MPs-CIP复合污染处理组的黑麦草叶片均出现白化现象，尤其MPs-CIP复合污染处理组黑麦草的白化现象更为显著，这可能与黑麦草体内叶绿素含量的变化相关. 如图4所示，与空白对照相比，单一微塑料污染物处理显著抑制了黑麦草体内叶绿素a、b含量(P<0.05). 单一CIP处理组和MPs-CIP复合污染处理组黑麦草叶片中叶绿素a、b含量均呈现随着CIP浓度的增加而逐渐减少的趋势. 其中，相同CIP浓度下微塑料的存在对叶绿素a、b的抑制作用更为明显. 50.0 mgL MPs-2.0 mgL CIP复合污染处理组黑麦草叶片内叶绿素a、b的含量最低，分别为21.1和5.8 mgg，与2.0 mgL CIP处理组相比，分别降低了38.5%和44.4%. 有研究[41]发现，高浓度的CIP可以抑制羊角月牙藻DNA复制，导致叶绿素含量降低；抗生素类污染物可通过抑制植物对微量营养元素的吸收，进而抑制光合作用和叶绿素的合成[42]. JIANG等[43]研究发现，银纳米颗粒可以显著降低水生浮萍(Spirodelapolyrhiza)体内叶绿素含量. 因此，微塑料的存在可能增强了CIP对黑麦草叶绿素合成的抑制作用.

注： 不同字母表示各处理组在0.05水平存在显著性差异(n=3).

当前，微塑料与其他污染物形成的复合污染的生物毒性和生物有效性的相关研究还处于初步研究阶段，该研究初步证实微塑料的存在会影响植物对抗生素的吸收去除并加重植物生长的毒性作用. 但该试验采用的微塑料能否进入并积累在植物体内，如何影响植物吸收及其体内转运抗生素的机理等仍有待进一步研究证实.

3 结论

a) 在单一CIP污染物和MPs-CIP复合污染物存在条件下，黑麦草均能吸收去除水体中的CIP，并且微塑料的存在会促进黑麦草对CIP的吸收，但其作用随着CIP浓度的增加而减少. 投加微塑料后，与单一CIP处理相比，黑麦草对0.1和2.0 mgL CIP的去除率分别增加了45.0%和3.1%.

b) 微塑料可以促进黑麦草根部积累的CIP向地上部转运. 与单一0.1 mgL CIP处理相比，50.0 mgL MPs-0.1 mgL CIP复合污染处理组黑麦草根部CIP的积累量降低了44.0%，而叶片中CIP的积累量增加了2.9倍.

c) 水体中的微塑料对黑麦草生长有抑制作用，微塑料与CIP共存会进一步加重CIP对黑麦草生长和叶绿素含量的抑制作用.