五氯苯酚对污泥性能和功能基因表达水平的影响

李 玉, 李刚强, 赵建国*, 张 珂, 金宝丹, 陈秀荣

1.郑州轻工业大学材料与化学工程学院， 环境污染治理与生态修复河南省协同创新中心， 河南 郑州 450001

2.郑州航空港区明港水务有限公司， 河南 郑州 450001

3.华东理工大学资源与环境工程学院， 上海 200237

氯酚类化合物被广泛用作杀虫剂、杀菌剂、木材防腐剂和除草剂等的前驱物或中间体，结果在一些市政废水和污染水体中检测到其浓度在μgL到mgL的范围内波动[1-2]. 另外，焦化废水和造纸废水等典型行业废水中也存在不同类型的氯酚类污染物，其浓度达到几十甚至上百mgL[3-4]. 氯酚类化合物对微生物、水生生物和植物以及人体等均会产生明显的危害，且随着苯环上氯代原子数量和分子体积的增加，氯酚类化合物越难以被微生物降解和毒性愈强[5-6]. 基于氯酚类化合物显著的毒性，抗生物降解特性和可能的“三致”效应，氯酚废水的处理受到广泛关注.

微生物代谢过程产生的不同酶类在降解氯酚类污染物和维持微生物活性等方面起到了关键作用，如加氧酶、脱氯酶和脱氢酶可实现氯酚类污染物的开环、脱氯和降解[1,14]，ATP酶可为氯酚类污染物的降解去除提供能量，超氧化物歧化酶(SODb)和脱氢酶可清除氯酚类污染物降解过程产生的自由基，具有保护微生物免于伤害的作用[15]，细胞色素p450可起到脱毒的作用，同时也是电子传递链上的关键酶[16]. 然而，在利用活性污泥工艺处理氯酚废水时，降解氯酚类污染物的优势菌群编码上述酶的功能基因表达鲜见报道. 考虑到Pseudomonas是一类广泛存在于不同环境的菌属，对废水中氯酚类污染物具有极强的降解能力[17-18]，因此探讨Pseudomonas代谢过程特定酶功能基因的表达具有重要的意义，可加强对不同微生物降解污染物机理的认识.

基于此，该研究以甲醇为共代谢碳源，利用HRT (水力停留时间)为8 h、SBR (间歇曝气的序批式生物反应器)处理进水浓度为2 mgL的PCP (五氯苯酚)废水，并与处理不含PCP的废水作对比分析，探讨PCP对污染物去除和微生物菌群的影响，并分析PCP诱导下污泥中Pseudomonas功能基因的表达水平，以期为难降解工业废水的深度处理提供科学指导.

1 材料与方法

1.1 试验方案

接种污泥取自当时市政污水处理厂好氧池，所取污泥用自来水清洗3次，曝气24 h后接种到2个SBR中. SBR的外径和高度分别为20和25 cm，有效体积为5 L. 初始污泥浓度(MLSS)为 3 200 mgL，通过排泥方式维持SBR运行过程的MLSS为(3 000±200)mgL. 试验所需废水为模拟废水，控制进水ρ(CODCr)为(300±20)mgL(由甲醇提供)，并补充微生物生长所需的N、P及微量元素(见表1).

表1 试验废水成分

调整SBR的HRT为8 h，单个SBR周期设置为0.25 h进水、7 h运行、0.5 h沉降、0.25 h排水，SBR运行结束后的换水率为70%. 为节约能量和避免微生物发生内源呼吸，利用定时开关控制SBR运行过程为间歇曝气模式，即曝气时间∶不曝气时间为2 h∶2 h，曝气阶段通过搅拌将污泥与DO充分混合，控制ρ(DO)为(1.5±0.5)mgL，不曝气阶段停止搅拌. 在整个SBR运行阶段，测得温度为(25±3)℃，通过NaHCO3溶液和稀盐酸调整进水pH为7.2±0.4. 当以甲醇为碳源的2个SBR出水ρ(CODCr)低于50 mgL时，其中1个SBR继续运行，为对照组. 另1个SBR投加进水浓度为2 mgL的PCP，为试验组，探讨PCP对污泥性能和功能基因表达水平的影响.

1.2 测定项目与方法

SBR运行过程的pH和ρ(DO)分别采用实验室FiveEasyTM pH计(METTLER TOLEDO，瑞士)和便携式DO计(YSI，美国)检测；出水ρ(CODCr)按照国家标准方法测定，即在SBR运行周期末，取上清液在 4 000 rmin下离心5 min，然后采用酸性重铬酸钾法测定；MLSS采用重量法测定，即将泥水混合液充分混匀后，取100 mL用已知质量的滤纸过滤，在105 ℃下烘干至恒质量，然后称量、计算；水相和泥相PCP采用高效液相色谱仪(HPLC，LC-10ATVP，Kyoto，日本)测定，固定相为反相C-18柱(250 nm×4.6 nm, 5 μm)，流动相为甲醇和超纯水的混合液，体积比为8∶2，其中超纯水中含体积分数为1%的醋酸. 流动相流速、测试波长、进样体积和柱温分别为1 mLmin、280 nm、10 μL和40 ℃. 水相PCP通过0.45 μm滤膜过滤后直接测定，泥相PCP通过超声萃取的方法提取，而后通过0.45 μm滤膜过滤测定. 通过多次重复试验，测得泥相PCP的萃取回收率在73.2%～93.4%之间.

1.3 微生物菌群分析

待试验组SBR运行至120 d后，污泥中基因组DNA利用溶酶菌-SDS-氯仿异戊醇法提取，细菌16S扩增上游引物(357-F-GC)和下游引物(518r)序列分别为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGGGCCTACGAGGCAGCAG-3′和5′-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3′. PCR反应和Reconditioning PCR反应按照BioLinker公司提供的说明书进行. 扩增后的PCR产物通过变性梯度凝胶电泳(40%～60%)分离，电泳结束后对凝胶染色并拍照，利用Quantity One软件对凝胶图进行分析，并用灭菌刀切割优势条带.

采用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收切割条带中的PCR产物，该PCR产物的二次扩增引物去掉GC发夹结构. 利用BioLinker公司的pED-T载体试剂盒克隆PCR产物. 挑选平板上的克隆，用Amp抗性LB培养基培养，待菌液培养至OD600 nm值为2～3时，对菌液进行PCR扩增，扩增产物送至上海BioSune生物技术有限公司进行测序. 为保证测序结果的准确性，每个样品做3个平行.

利用生物信息学软件对序列进行比对和筛选，去除T载体的引物. 将全部序列结果整理为FASTA格式的序列文件，在NCBI中进行BLAST比对. 将同一DGGE胶条中的3个克隆测序结果进行alignment分析，检测条带的一致性，并将比对结果中相似性最高的物种信息进行总结.

1.4 功能基因表达的分析

待试验组SBR运行至120 d后，采用Primer软件设计Pseudomonas的实时荧光定量PCR(qPCR)引物(见表2)，由生工生物科技有限公司合成. 通过qPCR技术检测SBR运行周期末污泥中所属Pseudomonas特定酶的功能基因表达水平，并与对照组作对比分析. 选取的酶为超氧化物歧化酶(SODb)、过氧化氢酶(CAT)、氨单加氧酶(AM)、细胞色素p450(CYP450)、ATP水解酶(ATPase)、甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)和脱氯水解酶(HDLH)，其对应的mRNA功能基因分别为sodB、KatG、amoA、p450、ATPase、gap和hdlh.

表2 荧光定量PCR引物

试验前对所需试剂和耗材进行去RNase处理，污泥总RNA的抽提利用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒，具体步骤按照说明书执行. 用微量分光光度计NanoDrop(Thermo,美国)检测提取的RNA浓度以及A260 nmA280 nm和A260 nmA230 nm，发现RNA纯度符合试验要求. 按照北京全式金生物公司提供的First-Strand cDNA Synthesis SuperMix提示逐步进行操作，根据提取的RNA浓度和纯度，通过逆转录配置第一条链cDNA合成的反应体系. 逆转录反应体系包含2 μL总RNA、1 μL随机引物、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript RTRI Enzyme Mix和6 μL无RNase水，将各样品的模板按上述反应体系配置后放入常规PCR仪，设定25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，最后85 ℃加热5 min失活. 按照Bio-Rad公司提供的NltraSYBR Mixture说明，以各样品的cDNA文库为模板，配置反应体系. qPCR反应体系为10 μL 2×UltraSYBR Mixture、2 μL正向qPCR引物(终浓度为0.2 μmolL)、2 μL反向qPCR引物(终浓度0.2 μmolL)、1 μL cDNA和5 μL去RNase水，将各组反应体系按照顺序依次加入96孔荧光定量PCR板，每个样品设置3个平行复孔，用透明qPCR封口膜封闭，在有吊篮的离心机下离心 (2 000 rmin)2 min后放入荧光定量PCR仪(BioRad CFX96, 美国). 根据引物Tm值，调整qPCR反应条件为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、55 ℃退火10 s和72 ℃延伸20 s，共计35个循环.

求3个平行孔数值的平均值，利用ΔΔCT法计算,其中ΔCT为样品平均值与内参平均值之差，ΔΔCT为样品与对照组所求得的ΔCT之差，计算出2-ΔΔCT值即是相应基因mRNA上调或者下调的倍数.

2 结果与讨论

2.1 进水CODCr和PCP的去除

当以甲醇为碳源的2个SBR出水ρ(CODCr)低于50 mgL时，试验组SBR投加进水浓度为2 mgL的PCP，对照组SBR继续运行. 由图1可见，对照组SBR出水ρ(CODCr)在31.6 mgL左右波动. 进水浓度为2 mgL的PCP对污泥毒性有明显的滞后效应，表现在试验组SBR第1天的出水ρ(CODCr)和对照组一致，均为42 mgL. 然而，从第8天开始，PCP显著抑制污泥活性，导致出水ρ(CODCr)超过100 mgL，直至运行至第90天，试验组SBR出水ρ(CODCr)才明显降低. 从第98天至SBR运行结束，试验组SBR出水ρ(CODCr)稳定在66.2 mgL左右，这说明进水PCP逐渐被降解去除，但出水ρ(CODCr)仍旧比对照组平均高出34.6 mgL，这表明进水PCP对活性污泥的毒性作用持续影响CODCr的去除.

图1 2个SBR反应器出水ρ(CODCr)的变化

1～20 d，水相、泥相PCP的残留量随运行时间的延长而增加，分别由第1天的0.76和1.17 mgL增至第20天的1.35和2.32 mgL(见图2)，单位时间内污泥吸附的PCP增加量为0.058 mg(L·d)，水相PCP的去除以污泥吸附为主. 20～90 d，水相、泥相PCP的残留量开始下降，第90天时分别降至0.43和0.52 mgL，这表明长时间的驯化诱使污泥降解PCP的优势菌群逐渐富集，吸附到泥相的PCP被降解去除，但积累到泥相的PCP仍旧抑制污泥活性，导致此期间出水ρ(CODCr)居高不下. 然而，随着泥相PCP的降解去除，污泥活性逐渐恢复，伴随着出水ρ(CODCr)的降低. 120 d时水相、泥相无PCP的残留，出水ρ(CODCr)也处于稳定水平.

图2 试验组SBR运行周期末水相和泥相PCP浓度的变化

2.2 降解PCP的污泥菌群结构分析

经PCP驯化的试验组SBR运行至120 d后，采用PCR-DGGE技术对污泥菌群结构进行分析，其图谱如图3所示，并与对照组作对比分析[18]. 对照组和试验组SBR的香农维纳指数(H)分别为2.19和2.71，即试验组污泥的微生物多样性显著高于对照组. 推断认为，对照组SBR进水碳源比较单一，主要为易降解的甲醇，导致污泥中富集的微生物多样性偏少，而试验组SBR进水PCP的毒性作用诱导污泥中微生物分泌丰富的次级代谢产物，同时PCP降解过程会产生多种代谢中间产物，结果不同类型碳源的降解过程会导致微生物多样性的显著增加. 前期的研究也证实相对于模拟废水，处理市政废水的微生物多样性更加丰富[19].

注： 不同数字代表鉴定的优势菌群.

对试验组SBR污泥的优势条带(见图3)进行鉴定分析，由表3可见，同一条带鉴定出不属于同一菌属的情况(条带2、4和8)，这可能是属于不同菌属的基因组DNA发生了共迁移现象或者是目的条带附近包含肉眼难以发现的低亮度相邻条带. 污泥中的优势菌属均属于变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，相关研究[20]也发现，属于变形菌门和厚壁菌门的菌属广泛存在于废水处理厂，在污染物去除方面起着重要作用. 对照组SBR污泥中的优势菌属主要包括Methylobacillus、Pseudomonas、Chondromyces、Ignavibacterium、Leadbetterella、Anaerobacillus和Proteiniclasticum[18]，其中部分优势菌属在试验组同样存在，表明该类菌属耐受PCP毒性的能力较强，如Chondromyces和Ignavibacterium，后者可将苯环降解开环[21]. 其他的优势菌属，如Thauera、Pseudoxanthomonas、Bosea、Achromobacter、Comamonas和Salimesophilobacter，广泛存在于降解氯酚及其他芳香烃污染物的活性污泥中，表明这些菌属在PCP降解过程起着重要作用[2,22-25].

表3 PCR-DGGE优势条带的BLAST比对结果

2.3 PCP诱导下污泥中菌属Pseudomonas功能基因的表达水平

废水中污染物的降解由微生物代谢过程产生的酶实现，而酶的编码和调控需通过功能基因来完成[26]. 因此，分析降解PCP的菌属中调控关键酶的mRNA表达水平具有重要的意义，可间接地反馈活性污泥系统不同酶的含量. 待试验组SBR运行至120 d后且处于稳定运行阶段时，SBR运行周期末污泥中菌属Pseudomonas的mRNA表达水平通过qPCR定量，并与对照组作对比分析，结果如图4所示. 试验组污泥中基因KatG、ATPase和p450的表达出现明显上调，分别为对照组的1.59、1.75和1.48倍，而基因sodB、amoA、hdlh和gap的表达则出现显著下调，分别为对照组的0.58、0.53、0.28和0.20倍，这表明微生物代谢过程的不同基因表达可受到PCP的抑制或激活.

图4 Pseudomonas功能基因表达的倍数变化

微生物代谢过程需要较多的能量抵抗PCP的毒性并将其降解去除，而基因ATPase的表达上调可合成更多的ATPase，为PCP的降解去除提供能量[27]. PCP降解过程会诱导微生物产生大量的氧自由基，进而导致微生物出现蛋白质变性、脂质过氧化和DNA损伤等问题，而基因KatG和p450的表达上调可合成更多的CAT和CYP450，清除微生物体内的自由基，维持其活性[28]. 基因sodB、amoA、hdlh和gap的表达下调意味着合成SODb、AM、HDLH和GAPDH的含量下降，推断这与PCP毒性抑制相关基因表达有关，而稳定运行阶段的试验组SBR出水ρ(CODCr)显著高于对照组也表明PCP抑制部分基因的表达，进而导致相关酶的合成量下降. 相关研究也发现低浓度污染物会诱导微生物部分酶的活性升高，而浓度过高则抑制酶的活性[29-30]，这与该研究结果一致. 后续需深入研究降解PCP的优势菌属相关功能基因表达被激活或抑制的机理，进而加强对不同微生物降解污染物机理的认识，为如何利用不同微生物菌群高效处理氯酚废水及其他工业废水提供科学指导.

3 结论

a) HRT为8 h时，SBR污泥活性受进水浓度为2 mgL的PCP抑制显著，出水ρ(CODCr)升高，PCP难以被降解去除(1～90 d). 然而，经长时间驯化的污泥降解PCP的优势菌属逐渐富集，进水CODCr和PCP被降解去除(90 d后). 但PCP的毒性作用导致其出水ρ(CODCr)显著高于对照组.

b) 经PCP成功驯化的污泥中富集的优势菌属主要为Chondromyces、Ignavibacterium、Thauera、Pseudoxanthomonas、Bosea、Achromobacter、Comamonas和Salimesophilobacter，均归属于变形菌门和厚壁菌门，在降解去除氯酚过程中起到重要作用.

c) 当降解PCP的SBR处于稳定运行阶段时，进水PCP可抑制或激活污泥中菌属Pseudomonas不同功能基因的表达水平，后续需深入研究降解PCP的优势菌属相关功能基因表达被激活或抑制的机理，进而加强对不同微生物降解污染物机理的认识.