红掌内生拮抗菌的分离及抑制作用初步研究

段辰君，王彦譞，刘慧芹,2,通信作者，罗丽丹，王蕴辉

红掌内生拮抗菌的分离及抑制作用初步研究

段辰君1，王彦譞1，刘慧芹1,2,通信作者，罗丽丹1，王蕴辉3

（1. 天津农学院 园艺园林学院，天津 300392；2.和田职业技术学院，新疆维吾尔自治区 和田 848000；3.天津绿之本生物科技有限公司，天津 301806）

以红掌为试验材料，采用平板对峙法从红掌中筛选了对病原菌有较强抑制作用的内生拮抗菌。结果表明：从红掌的根、茎、叶、花序分离出224株内生细菌、44株内生真菌、104株内生放线菌；从叶片中分离的内生菌最多，总共为139株，占62.05%。其内生细菌对病原真菌抑制作用要强于内生真菌和内生放线菌。其中Y-4、Y-6，Y-8、Y-80、G-43、J-14对8种植物病原真菌抑制效果较好。Y-6、Y-4、Y-8对4种植物病原细菌也有一定的抑制效果，抑菌率为8.7%～26.6%。从内生菌对红掌细菌性叶斑病菌的抑制作用来看，内生细菌Y-6的抑制效果最强，达49.61%。

红掌；内生菌；分离；抑制作用

植物内生细菌（Endophytic bacteria）广泛存在于健康植物的各个组织中，通过拮抗、诱导、促生、固氮等一系列作用方式，与植物及病原物互作并建立了稳定而复杂的互利关系[1]，因而也成为植物病害防治的重要生防资源[2]。目前，植物内生菌的种类繁多，但主要以细菌为主，多数集中在芽孢杆菌属（），如GAO等研究表明，来自于梓树叶片的ZSY-1对番茄早疫菌和灰霉菌有较好防治效果[3]；刘慧芹等从苹果中分离的G23对多种病原真菌有较强的抑制作用[4]。内生细菌中拮抗放线菌的数量也较多，如张盼盼等从南方红豆杉里分离出2个属的放线菌——链霉菌属（）和诺卡氏菌属（），共计109株内生放线菌[5]；更多的内生放线菌还具有拮抗作用，如从黄瓜分离到的放线菌SR-1102能有效拮抗黄瓜枯萎病 菌[6]。内生真菌较为复杂，种类繁多、数量庞大，在不同植物中存在状态差别明显，具有丰富的物种多样性[7-8]。

植物内生菌的来源非常广泛，多集中在蔬菜、果树、作物、药用植物等[3-7]，但关于花卉内生菌的研究相对较少，用于花卉病害的生物防治也鲜为报道。花卉作为重要的经济和观赏植物，随着花卉产业的发展壮大，其病害发生也相当严重。以红掌细菌性叶斑病为例，它是红掌的毁灭性病害，病原菌通过进口的红掌种苗进入我国，2003年首先在海南省发现，随后逐渐蔓延到全国多省[9]。该病害前期无任何症状，后期发病迅速，在红掌种植区域可造成50%～100%的种植量耗损，损失严重。目前，该病害尚无有效药物控制[10]，生物防治在国内更是空白，选育与种植抗病品种成为目前主要的防治措施[11]。因此，本试验对红掌进行内生菌的分离，并初步开展对病原菌有拮抗作用的菌株筛选，以期为后期红掌细菌性叶斑病及其他花卉病害的防治提供新的生防资源，并为今后开展植物病害绿色防控技术提供依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物：红掌（Linden），品种为‘维多’，由天津市花卉示范中心提供，试验材料取其根、茎、叶、花序。

供试菌株：番茄灰霉病菌（）、番茄早疫病菌（）、棉花立枯病菌（Kuhn）、黄瓜枯萎病菌（spOwen）、黄瓜疫病病菌（）、黄瓜灰霉（）、西瓜枯萎病菌（f. sp.）、萝卜黑斑病菌（）、黄瓜角斑病菌（pv.）、番茄疮痂病菌（pv.）、西瓜果斑病菌（subsp.）、大白菜软腐细菌（）、红掌细菌性叶斑病菌（pv.）由天津农学院植物病理实验室提供。

培养基：YDC培养基[12]、LB固、液体培养基、高氏一号培养基（GS）、PDA培养基[13]，所有培养基在120 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min。

1.2 内生菌的分离

将新鲜健康的红掌从盆栽中取出，用清水洗净，选取根、茎、叶、花序剪成小段在75%酒精中浸泡3 min，无菌水冲洗1次，重复3次。分别放在无菌研钵中，加少量无菌水研磨成匀浆，用移液枪吸取50 µL上清液，涂布到LB、GS平板培养基中，28 ℃倒放培养。将灭菌的材料撕去表皮放入PDA平板中，25 ℃恒温培养5 d。根据菌落的颜色、大小特征等挑取形态差异较为明显的菌落，纯化保存。从根、茎、叶、花序上分离的内生放线菌命名为AG、AJ、AY、AH；分离的内生细菌命名为G、J、Y、H；内生真菌的命名为FG、FJ、FY、FH。

1.3 对病原真菌有拮抗作用的内生菌的筛选

采用平板对峙法，将内生细菌依次与8种植物病原真菌做对峙，分别在PDA平板中央接入直径5 mm病原真菌菌块，在菌块四周放上小滤纸片，用移液枪分别吸取不同的4种内生细菌发酵液5 µL滴到小滤纸片。观察抑菌圈大小，初步筛选出对8种病原真菌都有抑制作用的内生菌。

1.4 对病原细菌有拮抗作用的内生菌的筛选

采用发酵液平板对峙法，将初筛的内生菌依次与4种病原细菌对峙。在混合了病原细菌发酵液的LB平板培养基上放两个小纸片，用移液枪吸取5 µL的内生细菌发酵液打到小纸片，观察抑菌圈。对照以小滤纸片上打入无菌水为空白对照，观察抑菌圈大小，重复3次。抑菌率（%）＝处理菌落直径/对照菌落直径×100。

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离

从红掌中分离的内生菌有372株（表1），其中细菌有224株，占所有内生菌的60.21%；放线菌有104株，占27.96%；真菌有44株，占11.83%。从分离的部位上看：根上分离出108株，其中有67株细菌，13株真菌，28株放线菌；茎上有80株内生菌，其中有45株细菌，10株真菌，25株放线菌；叶上共分离出139株内生菌，其中有89株细菌，16株真菌，34株放线菌；花序共分离出45株内生菌，其中有23株细菌，5株真菌，17株放线菌。总体来看，叶上分离的内生菌最多，而花序上最少。

表1 红掌各个部位分离到的内生菌数量及比例

2.2 内生细菌对植物病原真菌的抑制效果

从茎上分离出的内生拮抗细菌中，对棉花立枯病菌、黄瓜疫病病菌、番茄早疫病菌有抑制作用的数量较多，其比例分别为60.00%、53.33%、44.44%，高于对其余5种植物病原真菌的数量。从花序上分离出的内生拮抗细菌中，对黄瓜枯萎病菌和棉花立枯病菌有抑制作用的数量最多，其比例为47.83%、43.48%，明显高于对其余6种植物病原真菌的数量。从根上分离的内生拮抗细菌对8种病原菌有抑制作用数量都很多，其中对棉花立枯病菌有抑制作用的数量最多，为53.73%，对萝卜黑斑病菌的数量最少，为35.82%。从叶上分离出的内生拮抗细菌数量也较多，占到41.57%～50.56%（表2）。从不同的分离部位看，所分离的细菌对各种病菌有不同程度的抑制作用，大多集中在30.00%～50.00%，因此，具有拮抗作用的内生细菌的比例较高。其中Y-4、Y-6、Y-8、Y-80、G-43、J-14、Y-54等对这8种植物病原真菌都有较强的抑制作用（表2，图1）。

表2 不同部位内生细菌对植物病原真菌的抑制数量比例 %

图1 部分内生细菌对植物病原真菌抑制效果

注：1是Y-80、Y-6、Y-8、G-43对棉花立枯病菌的抑制，2是Y-6、Y-4、J-14、G-43对黄瓜灰霉病菌的抑制，3是Y-4、Y-54对黄瓜枯萎病菌的抑制，4是Y-6、Y-80、Y-4、J-14对黄瓜疫病病菌的抑制，5是Y-6、Y-8、G-43、Y-4对西瓜枯萎病菌的抑制，6是G-43、Y-4、J-14、Y-8对萝卜黑斑病的抑制，7是Y-4、G-43、Y-6、Y-8对番茄灰霉病菌的抑制，8是Y-8、Y-6、Y-4、J-14对番茄早疫病菌的抑制，9是Y-80、Y-6、Y-4、G-43对番茄灰霉病菌的抑制（4种内生细菌排列顺序为上、右、下、左）

2.3 内生细菌对植物病原细菌的抑制效果

内生细菌相对内生真菌而言对植物病原细菌的抑制作用较弱，筛选出Y-6、Y-4、Y-8对4种植物病原细菌有一定的抑制效果，其中内生细菌Y-6对大白菜软腐细菌的抑制效果最好，也只达26.6%；Y-4和Y-6对西瓜果斑病菌的抑制率最低，不超过10.0%；其余的抑制率则介于10.0%～20.0%，抑制效果不明显。

表3 3种内生细菌对4种植物病原细菌的抑制

2.4 不同内生菌对红掌细菌性叶斑病菌的抑制作用

通过内生菌对红掌细菌性叶斑病菌的抑制作用测定，表现为对该细菌有抑制效果的内生菌数量较少，其中Y-6（细菌）、AG-23（放线菌）、FY-3（真菌）分别在内生细菌、内生放线菌、内生真菌中的抑制效果最好（表4）。其中Y-6的抑制直径达4.17 cm，抑制率达49.61%；FY-3居中，抑制直径为3.67 cm，抑菌率为43.65%；AG-23抑制直径为3.10 cm，抑制率达36.9 %。

表4 内生菌对红掌叶斑病菌的抑制效果

3 讨论

内生菌存在于各种植物中，具有丰富的群落多样性。目前已报道在各种农作物及经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，主要为假单胞菌属（）、肠杆菌属（）、芽孢杆菌属（）、土壤杆菌属（）等；内生放线菌研究较多，主要为链霉菌属（）；真菌主要为子囊菌门[14]。而宿主则广泛存在于各种植物中，仅禾本科植物就达 290余种。内生菌在植物体中的分布具有普遍性、多样性的特点，可存在于植物的任何一个部位，其分布与植物种类、基因型、营养供给、器官、生长阶段和环境条件密切有关[15-16]。

本试验中分离出的内生细菌较多，有224株，占到总内生菌的60.21%，在生物多样性上处于优势菌群。从抑制效果上看，内生菌的拮抗作用相对较强，尤其是病原真菌效果明显。复筛得到的6株内生细菌Y-4、Y-6、Y-8、Y-80、G-43、J-14、Y-54均有良好的抑菌表现，这为后期开展红掌内生生防菌的研究奠定了基础。

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Preliminary study on the isolation and inhibition of endogenous antagonism of anthurium

Duan Chenjun1, Wang Yanxuan1, Liu Huiqin1,2,Corresponding Author, Luo Lidan1, Wang Yunhui3

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Hetian Polytechnic, Hetian 848000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3. Tianjin Lüzhiben Biotechnology Co. Ltd, Tianjin 301806, China）

In this paper, the endophytic antagonisticmicrobes with strong inhibitory effect on pathogen were screened from anthurium by plate confrontation method. The results showed that 224 strains of endophytic bacteria, 44 strains of endophytic fungi and 104 strains of endophytic actinomycetes were isolated from the root, stem, leaf and inflorescence. The most endophytic bacteria were isolated from the leaves, a total of 139 strains, accounting for 62.05%. The inhibition effect of endophytic bacteria on pathogenic fungi was stronger than that of endophytic fungi and endophytic actinomycetes. Among them, Y-4, Y-6, Y-8, Y-80, G-43 and J-14 had better inhibitory effects on 8 kinds of plant pathogenic fungi. Y-6, Y-4 and Y-8 also had certain inhibitory effects on 4 kinds of plant pathogenic bacteria, and the inhibition rate ranged from 8.7% to 26.6%. In terms of the inhibitory effect of endophytic bacteria on, the inhibitory effect of endophytic bacteria Y-6 was the strongest, reaching 49.61%.

anthurium; endophyte; isolation; inhibition

1008-5394（2020）04-0039-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.04.008

Q939

A

2020-04-10

天津市高校中青年骨干创新人才培养计划（J01009030709）；大学生创新创业训练计划项目（201910061158）；宝坻区农业科技计划项目（2018035）；天津市企业科技特派员项目（20YDTPJC01330）

段辰君（1999—），女，本科在读，主要从事植物病理学研究。E-mail：844722962@qq.com。

刘慧芹（1973—），女，副教授，博士，主要从事植物病理学研究。E-mail：wjxlhq@126.com。

责任编辑：杨霞