单克隆抗体及其抗感染作用的研究进展

崔乐乐， 卜 桐， 刘兆基， 张涵旭， 史 雨， 井雯雯， 李爱梅， 考文萍， 翟爱霞

(哈尔滨医科大学 微生物学教研室，伍连徳研究所，黑龙江省感染与免疫重点实验室，黑龙江省普通高校病原 生物学重点实验室，黑龙江省普通高校感染与免疫科技创新团队，黑龙江 哈尔滨 150081)

1 单克隆抗体的发展历程

B细胞由抗原刺激后可增殖分化为浆细胞，浆细胞进一步产生糖蛋白，即抗体(antibody, Ab)。Ab也称为免疫球蛋白，能与相应的抗原特异性结合，是介导体液免疫的主要效应分子，大部分存在于血清中。分子生物学家Koehler和Milstein在1975年合作建立了单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)技术，该技术制备的第一个杂交瘤细胞株可分泌抗绵羊红细胞特异性抗体，仅能识别一种抗原表位，并且这种细胞在体外培养可永久传代[1]。这一发现使得抗体的研究取得了巨大进步。到目前为止，mAb经历了鼠源性单抗、人鼠嵌合单抗、人源化单抗和全人源单抗四个发展阶段，其中全人源单克隆抗体(fully human monoclonal antibody)是目前较为先进、使用范围较广的一类mAb[2]。

1.1 鼠源性单抗

鼠源性单抗是免疫小鼠的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞所分泌的抗体，人的免疫系统可识别这种抗体，并产生严重的人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody, HAMA)，HAMA反应使单抗的半衰期变短，疗效减弱，引起严重的不良反应[3]。并且由于制备鼠源性单抗所需时间较长，单抗的抗性易丢失。为了克服鼠源性单抗存在的一系列的缺点，制备出合适的单克隆抗体，人们对于mAb开始了进一步的研究[4]。

1.2 嵌合型单抗

嵌合型单抗是第一代人源化抗体。该种抗体的制备过程是对鼠抗体上的可变区基因与人抗体的恒定区基因进行重组后导入到骨髓瘤细胞中，其表达产生的抗体即为嵌合型单抗。然而，由于这种抗体的可变区来自小鼠基因，保留了约30%的鼠抗体特性，所以对人体有免疫原性。在临床应用中，用该抗体治疗的患者可发生HAMA反应[5]。基于这一原因，研究人员对mAb进一步人源化，使抗体的免疫原性降低，减少HAMA反应的发生。

1.3 人源化单抗

第二代人源化抗体又称为改形抗体，移植抗体或人源化抗体。是用鼠单抗可变区中的互补决定簇(complementarity determiningregion, CDR)序列取代人抗体可变区中的相应位置，人源化可达90%以上[6]。这种抗体既有鼠源性单抗特异性，又保持与人体内的亲和力，可最大程度上降低抗体的异源性。但该抗体只是对CDR序列进行简单的移植，没有考虑到抗体结构发生改变会对抗体抗原的结合产生怎样的影响。而且人源化单抗中仍包含鼠源抗体的结构，所以不可避免地会发生HAMA反应[3,7]。同时在人源化抗体制备过程中有很多难点，比如制备过程复杂，需要进行结构设计，并需反复检测与抗原的亲和力大小等等。

1.4 全人源单抗

全人源单克隆抗体是治疗性单克隆抗体中最理想的抗体。这种mAb可以消除人对异源性抗体的不良反应，避免了异源抗体重组的复杂性[3]。制备全人源单抗的技术主要包括噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术、转基因小鼠技术等[8]。

1.4.1 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是对人抗体结构中的重链和轻链可变区基因逆转录，将人抗体转染到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达。通过这一技术可得到含有抗体基因并且能够成功表达抗体的噬菌体[9]。该技术利用抗原抗体特异性结合的特点对全人源抗体可变区基因进行筛选，确定目的基因后进行扩增[10]。目前已知该技术有两种类型：免疫抗体库和非免疫抗体库[9]。

1.4.2 核糖体展示技术 核糖体展示技术是对编码蛋白的DNA在体外进行转录和翻译，具体来说是对DNA进行特殊的加工并修饰，去除3′末端的终止密码子，使核糖体翻译到 mRNA 的3′末端不会脱离下来从而形成蛋白质-核糖-mRNA三聚体，再将目标蛋白配基固相化，筛选得到复合物。将得到的mRNA进行RT-PCR，其产物进入下一轮循环。经过多次循环，对目标蛋白及其编码的基因序列进行富集和分离[11]。

1.4.3 转基因小鼠技术 转基因小鼠技术是将人染色体转移到小鼠体内，用人IgG基因代替转基因小鼠体内的相应基因，使小鼠能分泌人IgG。但是由于基因片段较小，不足以应对抗原多样性[12]。基于这一原因，研究人员用基因打靶技术将长度约为18 Mb编码人抗体的轻重链基因片段全部导入到已灭活的小鼠自身抗体的基因位点上，挑选合适的基因片段，建立稳定的转基因小鼠品系。这种转基因小鼠可产生高亲和力的人源抗体。并且小鼠体内分泌特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞可分泌人源抗体[13]。

无论如何，单抗对于一个个体来说是抗原，会产生抗抗体使其失效，或者引起病理性免疫反应。鼠源型、嵌合型和人源化单克隆抗体都有鼠源性片段，会不可避免的产生HAMA反应。全人源mAb或人源化mAb在人体中具有免疫原性，并且可以诱导抗药物抗体(anti-drug antibody ADA)的产生，影响药代动力学(pharmacokinetics，PK)和单抗的作用效力[14-15]有研究表明阿达木单抗治疗的类风湿患者体内ADA滴度越高，治疗失败的可能性越大。没有证据表明全人类单克隆抗体的免疫原性低于人源化抗体[16]。

2 单克隆抗体的作用

mAb在疾病的诊断和治疗上越来越受到重视。为治疗类风湿性关节炎，Yamanaka等研发出一种全人源单抗药物Adalimumab，这是第一个全人源单抗药物[17]。之后又研发出用于治疗直、结肠癌的全人源单抗药物[18]。mAb主要用于诊断和治疗肿瘤、自身免疫性疾病、传染病、炎症和免疫失调等疾病，在类风湿关节炎、克罗恩病、复发恶性胶质瘤、转移性大肠癌等疾病的治疗中应用较多。

mAb在肿瘤的治疗中应用较多，mAb抗肿瘤的机制主要是抗体与肿瘤细胞表面特异性抗原分子结合，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和补体依赖性细胞毒作用，进而杀灭肿瘤细胞[19]。利妥昔单抗和化疗药物CHOP联合使用方案(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)可有效提高淋巴瘤的治愈率，曲妥珠单抗与化疗的联合治疗方案对乳腺癌有效[20-21]。此外西妥昔单抗可以治疗头颈部癌、非小细胞肺癌和结肠癌等多种肿瘤，并且有很好的疗效[5,21,23]。黄晶晶等[24]建立了高效表达系统，制备出TR1-419单抗和TRAIL-R1。已知TRAIL-R1具有抗肿瘤作用，将TR1-419与TRAIL共同作用于HeLa细胞，TR1-419对TRAIL杀伤肿瘤细胞的功能具有促进作用，并导致凋亡信号转导通路的激活。同时体内实验也证明了TR1-419可增强TRAIL的抑制肿瘤生长作用。

现在有关mAb治疗肿瘤的研究仍在进行，并且取得了很多的成果。

3 单克隆抗体的抗感染作用

mAb在抗感染方面也有很大的进展。感染是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体入侵人体后使得人体局部组织或全身发生炎症反应。感染可引起伤寒、败血症、心肌炎等各种疾病。目前最常用干扰素(interferon, IFN)对病毒感染进行治疗，尚无其他更有效的药物对感染性疾病进行干预。抗生素的作用机制是通过抑制或杀灭细菌生长从而达到治疗的效果。但抗生素的滥用大大增加了细菌的耐药性。针对这一现象，一些学者将目光投向mAb，研究具有抗感染作用的mAb。mAb在进入人体后通过人的免疫系统消除病原体，也可阻断相关的发病机制，提高机体的免疫力，从而达到治疗疾病的效果。目前mAb在抗感染方面仍处于研究阶段。

3.1 单克隆抗体在治疗病毒性心肌炎的研究进展

心肌炎是心脏发生炎症性疾病和扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)的征兆，细胞浸润是心肌炎的主要特征[25]。其中病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是一种由T细胞介导自身免疫性疾病。Fairweathe等[26]用感染柯萨奇病毒(coxsackievirus, CVB)的小鼠建立疾病模型。通过实验发现，患病的雄性小鼠体内炎症程度明显，CD45+、CD11b、CD4+、CD8+等的表达水平都明显增加。并且小鼠心肌发生明显纤维化。并且Koichi等[27]对动物模型的研究发现，Th1和Th2在扩张型心肌病的发展过程中扮演着重要的角色。其中Th2通过减少调节性T细胞(Treg)和炎性细胞因子的生成，从而抑制Th1免疫反应和急性病毒性心肌炎。Yuan等[28]发现IL-17 mAb处理的AVMC小鼠体内血清CK-MB活性降低，心脏切片的病理评分有所改善，IL-17水平和血清抗ANT自身抗体降低。所以，IL-17可以作为治疗病毒性心肌炎和扩张型心肌病的靶点。

3.2 单克隆抗体在巨细胞病毒感染中的研究进展

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, hCMV)为DNA病毒，在细胞中处于休眠状态，但可以由相关刺激因素激活。通常导致免疫功能低下的个体发生严重疾病，在心血管疾病和癌症的发病机制中发挥重要作用，与肝炎、单核细胞增多症、发烧、疲劳等疾病和临床症状有关。大部分hCMV的亚型可引起轻度的上呼吸道感染，也可在体内建立持续感染而不产生任何临床症状[29]。hCMV可编码多种蛋白，其中编码的囊膜糖蛋白为主要抗原，可诱导机体产生抗体。囊膜糖蛋白主要包括 gB(UL155)、gH(UL75)、gL(UL115)、gO(UL74)、gM(UL100)和 gN(UL73)等，其中gB含量最高，参与病毒的吸附与融合[30]。MSL-9是最早研发出来治疗CMV的mAb，可高效结合gH，但临床试验中发现高剂量的MSL-9可造成患者死亡[31-32]。有研究通过杂交瘤技术和连续稀释法制备出针对gB抗原的两种mAb，分别为ZJU-FH6和ZJU-FE6，通过ELISA、western blotting、免疫沉淀和免疫组化对两种mAb进行验证，表明两种mAb能够准确地识别患者体内的gB抗原[33]。在体外实验中，ZJU-FH6和ZJU-FE6两种抗体在实验小鼠体内都表现出了良好的免疫原性，但仍需进一步的临床试验。TRL345是另一种针对CMVgB中AD-2表位的单克隆抗体。它主要针对感染的内皮细胞，平滑肌细胞和原始纤维细胞起作用[34]。且有临床试验表明该抗体可中和CMV，并可阻止病毒感染胎盘绒毛组织，在临床治疗上有较好的前景。

3.3 单克隆抗体人类免疫缺陷病毒感染中的研究进展

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)可分为HIV-1 型和 HIV-2 型。获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的主要病原体是 HIV-1，其包膜糖蛋白 gp160 进一步加工形成gp120 和 gp41[35]。HIV入侵人体后，病毒的外壳蛋白 gp120 三聚体与人的CD4受体、趋化因子协同受体(CCR5、CXCR4)结合，从而导致AIDS的发生[36]。针对该病毒的mAb还处于临床试验阶段。目前已经制备出一种mAb，Ibalizumab是一种抗CD4 mAb，属于人IgG4亚型。由鼠mAb(mu5A8)衍生而来，不诱导免疫抑制反应，也不降低CD4+T细胞计数，是一种特异的抗CD4 mAb[37]。Ibalizumab能选择性地与CD4受体结构域上的表位结合[38]，并抑制HIV的gp120、gp41与 CD4 结合，从而改变病毒构象，阻止病毒进入细胞[39]。有研究结果表明，与单独使用逆转录疗法相比，Ibalizumab与抗逆转录病毒疗法联合应用于AIDS效果更好。

近年来，Huang等[40]研发出针对HIV病毒的单抗药物35O22，这种单抗药物可与病毒包膜糖蛋白表位结合。35O22抗体在艾滋病毒的预防、治疗以及使用疫苗刺激HIV特异抗体等方面有较好的效果。35O22独特的结合位点和对HIV病毒毒株的作用表明，它可以与被动免疫疗法或病毒预防中使用的其他抗体相补充。在病毒滴度较低的情况下，35O22抗体在体内的活性会可能持续存在。

3.4 单克隆抗体在登革热病毒中的研究进展

登革热(dengue fever, DF)和登革出血热/登革休克综合征(DHF / DSS)是通过节肢动物传播的感染性疾病。DF发病急，症状严重，在发病早期可快速有效地对疾病进行实验室诊断[41]。Creuza Rachel Vicente等[42]对2009年到2013年间巴西Vitória的DF病例进行统计分析，发现DENV-2感染病例发生严重DF的频率是其他血清型的7倍。目前mAb可用于诊断血清型，并且比传统检测方法灵敏度更高，所需时间更短。Vazquez等[43-44]制备了8H8mAb，对登革热C蛋白进行特异性酶免疫分析，结果表明8H8mAb可对早期DF进行诊断。但目前针对DF的mAb仅用于诊断登革热病毒感染，治疗DF的单抗仍处于临床试验阶段。

3.5 单克隆抗体在肉毒杆菌感染中的研究进展

肉毒杆菌中毒是由肉毒杆菌中存在的神经毒素引起的疾病。肉毒杆菌有7种血清型，其中C型与牛、野生鸟类、貂、马、狐狸等动物的肉毒杆菌中毒有关[45]。肉毒杆菌的发病机理是肉毒毒素通过胞吞作用进入胆碱神经细胞，毒素进入细胞质后，会破坏突触小泡，导致无法释放乙酰胆碱，从而引起肌肉松弛性麻痹。当波及到呼吸肌时，可导致呼吸困难甚至死亡[46]。

ELISA为常用的检测肉毒杆菌的方法。通常使用14G8 mAb作为一种捕获抗体，可以确定活跃的细菌数量，同时也可检测包含BoNTC(/d)的血清样本及其特异性[47]。在小鼠的体内实验中，通过对小鼠注射14G8，可以延迟小鼠的死亡时间。但是14G8 mAb的不恰当使用对中毒的小鼠不起任何作用。14G8与NCTC 8264的结合可以更有效的延长小鼠的生存时间。这也表明多种抗体联合效果更显著。目前mAb对肉毒杆菌中毒的治疗效果仍处于试验阶段。

3.6 单克隆抗体在葡萄球菌感染中的研究进展

葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins, SEs)是金黄色葡萄球菌分泌的一种毒素，在食物中广泛存在，可导致许多疾病的发生，包括败血症、食物中毒和毒性休克综合征等[48]。SEs有5种血清型：SEA、SEB、SEC、SED、SEE[49]。在单一细胞融合试验中，通过给小鼠注射多种抗原，可对常见抗原的mAb进行筛选。通过实验制备的mAb-4G3(IgG2b)、mAb-5G2(IgG1)和mAb-9H2(IgG1)3种mAb都能够抑制葡萄球菌超级抗原(staphylococcal superantigens)诱导的人免疫细胞的增殖和细胞因子的产生[50]。用mAb检测葡萄球菌肠毒素效果较为理想，并且快速、特异性强、敏感度高。mAb在小鼠体内作用的效果较为明显，但在人体中的作用尚在试验阶段，效果未知。

4 展 望

到目前为止，单克隆抗体的研究已经取得较大的进展。鼠源型、嵌合型和人源化单克隆抗体都具有异源性，会对人体产生不同程度的HAMA反应。单克隆抗体特异性较强且效价高，主要用于疾病的诊断和治疗。其中在肿瘤和自身免疫疾病等方面应用较多，并且单克隆抗体已经成为某些疾病的主要治疗方案。针对治疗感染性疾病的单克隆抗体研究尚不成熟，多数还处于临床试验阶段，更多的是用来检测及诊断感染性疾病。单克隆抗体与目前抗菌和抗病毒药物的作用机制不同，单克隆抗体可直接增强人体免疫系统消灭病原体，从而达到治疗疾病的效果，并且靶向性强，特异性高、毒副作用低，对病毒感染有良好的抑制作用，单克隆抗体的这些优点越来越受到科研人员的关注。目前单克隆抗体治疗感染性疾病体外试验前景较好，小鼠体内实验效果也较为理想，但尚未应用到临床中。此外，全人源单克隆抗体由于消除了异源性、特异性高和最大程度上避免了不良反应等优点，在各种疾病的治疗研究中成果显著。在未来的研究中，全人源单克隆抗体将会越来越多的应用于疾病的诊断及治疗，在抗感染方面也会发挥着更大的作用。从第一种全人源单抗药物Adalimumab治疗类风湿关节炎开始，在医学研究迅猛发展的今天，全人源单克隆抗体应用于临床治疗指日可待。