再生障碍性贫血患者造血微环境变化的研究进展

尹相丛，杨颉， 闫丽萍，赵春亭

青岛大学附属医院，山东青岛266001

造血微环境是指骨髓造血细胞增殖、分化的全部环境因素，是由基质细胞、细胞外基质和造血生长因子三部分组成的[1]，其共同构成了造血细胞存活所必需的生理结构支架和信号传导载体[2]，是造血系统的重要组成部分，具有支持造血细胞增殖及促使造血细胞向各个血细胞增殖分化的作用。再生障碍性贫血(AA)是由于物理、化学、生物或其他不明因素作用使骨髓中造血干细胞(HSC)和骨髓造血微环境受损，造成骨髓造血功能降低或衰竭，并以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。AA的发病机制涉及免疫紊乱、造血微环境改变等多个方面。本文对AA患者造血微环境的相关变化作一综述。

1 骨髓间充质干细胞(BMSCs)相关异常

1.1 细胞增殖缓慢、数量减少、特性改变 骨髓基质细胞主要包括BMSCs、成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成骨细胞等，是造血微环境的重要成分之一，能够分泌多种造血调控因子。BMSCs是骨髓基质细胞的前体细胞，主要来源于中胚层，是一种具有多向分化潜能的干细胞[3]，能够分泌多种细胞因子，具有低免疫原性、免疫调节性及支持造血的功能[4]。在一定的诱导条件下，BMSCs可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、骨髓间质细胞等多种间质细胞[5]。在维持骨髓微环境稳态、调控HSC的生理功能中发挥着重要作用[6]。研究发现，与正常成人相比，AA患者BMSCs数量减少、增殖能力降低、生长缓慢，且促进骨髓粒细胞-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)生长的作用明显减弱[7]。BMSCs增殖缓慢、数量减少、特性改变均与AA严重程度、病程等有关，BMSCs的上述变化在重型、病程较长或继发于放化疗后的AA患者中尤其明显。

1.2 抑制T淋巴细胞的作用减弱 正常的BMSCs具有抑制T淋巴细胞的功能，可为HSC提供免疫保护环境。正常人BMSCs可抑制植物血凝素刺激后的T淋巴细胞增殖，且这种作用会随着BMSCs数量的增加而增强。AA患者BMSCs在细胞形态和免疫表型上与正常人没有明显差异，但其BMSCs对T淋巴细胞的抑制作用较正常人减弱[8]。BMSCs能够使T淋巴细胞停留在G0或G1期，从而抑制T淋巴细胞的增殖和活化，并使CD25、CD69等T淋巴细胞早期活化表型的表达下降，抑制IL-2、IFN-γ分泌，而AA患者的BMSCs缺乏这种免疫抑制作用。Bacigalupo等[9]也发现，重型AA患者的BMSCs在抑制T淋巴细胞生成、增殖方面存在不足，且不能通过免疫治疗得到纠正，但经HSC移植后可恢复正常。BMSCs对T淋巴细胞的抑制作用减弱会影响骨髓局部的免疫调节，从而影响骨髓正常造血。

1.3 成脂性增强 正常情况下BMSCs成脂和成骨分化处于动态平衡，而AA患者BMSCs成脂及成骨分化发生失衡[10,11]，AA患者骨髓中正常造血组织减少并被脂肪组织取代。研究发现，AA患者BMSCs向脂肪细胞分化的能力增强，形成脂滴时间早、数量多、体积大；且在诱导BMSCs形成脂肪细胞的过程中，早期脂蛋白酯酶基因表达明显升高。在正常人的脂肪细胞诱导体系中，转化生长因子β1(TGF-β1)可促进 BMSCs增殖，并抑制其成脂分化。而AA患者BMSCs的易成脂性可能与TGF-β1信号传导通路出现异常，TGF-β1及其下游第1个分子信号Smad3表达下调有关。另有研究发现，AA患者BMSCs脂肪化能力明显增强[12]，且脂联素、FABP基因及蛋白表达显著升高[13]。AA患者BMSCs成脂性增强导致成骨细胞减少，而成骨细胞也被证实参与了对HSC早期分化调控的介导，是骨髓造血微环境中重要细胞成分之一，在HSC发育、增殖、分化及成熟过程中发挥重要的调控作用[14]。成骨细胞数量减少将影响骨髓HSC的增殖和分化，也可直接影响骨髓基质细胞间的相互作用，导致造血微环境异常。另外有研究表明，骨髓脂肪细胞可过度分泌瘦素等细胞因子，而且AA患者HSC对干细胞因子(SCF)的反应性降低并且其瘦素受体不完整，均破坏了瘦素与SCF刺激HSC增殖的协同效应，可能进一步导致AA患者瘦素水平增高及HSC数量减少。因此，BMSCs成脂性增强导致造血微环境改变可能是AA患者骨髓功能减弱的原因之一。

1.4 细胞凋亡增加 研究表明，AA患者BMSCs凋亡率明显升高，导致BMSCs数量减少，同时也对HSC产生影响[15]。通过基因芯片分析骨髓BMSCs结果显示，AA患者大量与细胞增殖、分化、凋亡、造血发生及免疫应答等相关的基因表达发生明显改变，也进一步证实了AA患者BMSCs的生物学特性发生异常[16]。

2 细胞外基质改变

AA患者最主要的骨髓病理表现是造血细胞减少、脂肪细胞增多，同时伴有骨髓基质细胞萎缩、成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)减少、静脉窦壁水肿、毛细血管坏死等现象，其中急性AA较慢性AA更明显。而骨髓基质细胞受损的患者行HSC移植的成功率比较低，也提示造血微环境缺陷在AA发病中具有重要作用。

AA患者骨髓微环境中存在微血管破坏和血管新生减少[17]。Füredre等[18]应用免疫组化法检测AA患者骨髓中微血管密度和血管内皮生长因子(VEGF)表达，结果发现初诊AA患者骨髓微血管密度及VEGF表达均明显低于正常人群，而治疗有效后的AA患者两者水平明显提高。VEGF是对血管生成和造血具有重要作用的因子之一。AA患者VEGF表达降低可减少骨髓血管生成，引起骨髓局部氧供和血供均降低，从而使造血组织萎缩，骨髓出现脂肪化，导致正常的造血功能受到抑制。VEGF可通过内在的自分泌环调节和维持HSC生存和增殖，VEGF表达过低可直接影响HSC增殖、发育和分化，从而影响造血功能。因此，VEGF表达降低可能与AA的发生、进展及病情严重程度有关。国内还有研究发现，AA患者骨髓源血管紧张素Ⅱ水平低于正常人群，推测骨髓血管紧张素Ⅱ水平降低也可能是AA患者造血微环境改变的重要因素之一。

AA患者血管细胞黏附分子1及细胞间黏附分子1等基因表达增高，而整合素1与整合素133等基因表达下降，说明AA患者骨髓微环境中HSC与基质细胞及细胞外基质成分间的黏附相互作用被破坏，导致HSC过早凋亡。另外TGF-β1参与了免疫调控及造血调控，可能也与AA的发病有关。TGF-β1是由Th3细胞分泌的，对免疫应答发挥负调节作用。研究发现，重型AA患者血浆TGF-β1水平明显下降，且与Th3细胞比例及血小板数量呈正相关关系，说明Th3细胞及其分泌TGF-β1水平可反映重型AA患者的病情。TGF-β1减少可能减弱了自身免疫耐受，使T淋巴细胞针对自身骨髓的免疫破坏功能亢进。

3 HSC相关异常

HSC是由胚胎干细胞发育而来的各类血细胞的祖源细胞，能够自我更新、自我复制，且有较强的多向分化能力。AA患者的HSC异常已得到公认[19]。AA患者应用免疫抑制治疗后有效率可达70%～80%，但仍有一部分患者存在缓解率低、造血功能恢复不理想和复发等问题，而HSC移植成功后患者骨髓造血功能恢复，也表明其骨髓可能存在HSC数量及功能异常。

3.1 HSC细胞数量减少 HSC又被称为多能干细胞，CD34+是其特异性标志，AA患者骨髓中的CD34+细胞比例明显低于正常人，且其降低程度与病情严重程度呈正相关关系；同时AA患者骨髓启动细胞(LTC-IC)数量明显减少甚至缺乏，CFU-GM和红细胞集落形成单位(CFU-E)形成能力降低。AA患者HSC异常主要是HSC数量减少造成的，尤其是表达CD34+、CD38-的早期HPC数量明显减少甚至缺乏。研究证实，AA患者骨髓中不仅HSC数量降低，而且集落形成细胞或经原始细胞长期培养的纯化CD34+细胞比例也低于正常人群[20]。Fischer等[21]研究发现，儿童AA患者骨髓CD34+细胞比例也明显降低，而CD34+细胞表面相关凋亡诱导配体(TRAIL)表达增加。CD34+主要表达于早期造血干细胞，在其黏附和归巢过程中具有重要作用。因此，检测骨髓中CD34+细胞的表达水平已成为诊断AA的方法之一，也可以初步评估AA患者的严重程度，并有助于治疗方法的选择以及预后判断。CD34+细胞极度降低的患者往往免疫抑制治疗效果不理想，可能与未从根本上纠正干细胞的内在缺陷有关。但是经同基因HSC移植成功后，患者的造血功能可得到恢复，也提示了AA患者存在HSC数量及功能异常。因此，临床上应用HSC移植和抗胸腺细胞球蛋白联合环孢菌素A和雄激素治疗AA的效果较好[22,23]。

3.2 HSC细胞功能异常 AA患者不仅存在HSC数量降低，还存在细胞功能异常。研究发现，将AA患者CD34+细胞置于正常人的髓基质中培养，可出现集落生成障碍；反之，将正常人CD34+细胞置于AA患者的骨髓基质中培养，集落生成则无显著差异；这表明AA患者的HSC可能存在功能缺陷或异常。临床上部分AA患者经正常人HSC进行骨髓移植治疗后取得良好效果，也证明了AA患者HSC存在功能异常或缺陷。研究证实，虽然AA患者的骨髓造血功能衰退，但其体内大部分造血生长因子水平与正常人相比并没有明显变化。由此推测，HSC对造血生长因子的反应性降低甚至无反应，可能是由于受体分布、功能、胞内合成及细胞内信号传导等因素异常而导致的，最终影响患者的骨髓造血功能。

3.3 HSC细胞凋亡增加 细胞凋亡异常是HSC损伤的重要机制之一，AA患者骨髓HSC细胞CD34+细胞上死亡或凋亡的相关基因及造血负调控因子表达明显升高。AA患者HSC凋亡增加与造血生长因子减少、促凋亡细胞因子增多、凋亡相关分子表达增加等因素有关。造血负调控因子可通过一些信号途径参与诱导HSC凋亡，而Fas和Fas配体(FasL)是一对促凋亡基因，其中Fas(Apo-1/CD95)蛋白属于TNF和神经生长因子受体成员之一，FasL属于TNF家族成员。AA患者IFN-γ和TNF-β等造血负调控因子表达升高，可上调CD34+细胞上的Fas抗原表达；同时使其对Fas/FasL途径介导的细胞凋亡敏感性增加，通过Fas/FasL途径启动细胞凋亡程序，使凋亡细胞比例增加[24]。

研究表明，NO也可能参与了AA患者HSC异常凋亡，IFN-γ、TNF-α和IL-1等可诱导NO合酶的合成，NO生成增加，导致HSC的DNA损伤，从而引起细胞凋亡增加[25]。IL-1B也可通过IL-1B转化酶途径促进HSC凋亡，而CTL介导的细胞毒作用可导致HSC的直接损伤。最近有研究显示，正常CD34+细胞的存活与自噬密切相关，而AA患者CD34+细胞的自噬能力受损，导致CD34+细胞的分化和增殖减少，而对凋亡的敏感性增加[26]。因此，自噬可能在AA的发病机制中发挥重要作用。

4 基因改变

4.1 人白细胞抗原(HLA)基因多态性 HLA是由200多个基因座位组成的基因复合体，其编码的基因位于第6号染色体短臂上6p21.3，全长4 000 kb。HLA与调节免疫应答有关，在目前已知基因中HLA等位基因的多态性最高。国内外报道均显示，HLA等位基因多态性与AA发病易感性有关[27]。某些HLA表型在AA患者中的比例较高，呈连锁不平衡，HLA-DR2阳性可作为AA患者免疫抑制治疗的预测指标[28]。通过对AA患者的HLAⅡ类抗原进行分析，发现环孢素A依赖者具有共同的HLAⅡ类单体型DRB1*1501、DQA1*0102、DQB1* 0602，且其第2外显子无核苷酸序列多态性，而对环孢素A治疗有效但不依赖者则不具备这些分型特征[29]。HLA-DRB1*150是HLA-DR2的主要亚型，很可能是AA的易感基因之一。Taj等[30]研究发现，AA患者的 HLA-B5基因频率明显高于正常人。Akram等[31]发现，HLA-DRB1*15和DQB1*06与巴基斯坦人群AA发病密切相关。而Wang等[32]研究发现，在中国北方汉族人群中，HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1等位基因多态性与AA的发病有关。HLA-B*1302、HLA-B*3501、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0901和 HLA-DQB1*0202可能是AA的易感基因 ，而HLA-A*3303和HLA-DQB1*0302可能是AA的保护基因。以上研究结果均提示，HLA-DR基因的某些亚型可能是导致AA发病的遗传学基础。

4.2 端粒酶改变 端粒是由DNA及其相关蛋白组成的富含G的DNA重复序列，存在于真核细胞染色体末端，能够保护染色体末端不被降解、融合和重组，具有保证染色体完整性的作用。端粒的长度决定了细胞的复制潜能，体细胞每分裂1次，端粒就会缩短50～200 bp，当端粒缩短到一定程度就会导致细胞复制的停止，细胞会因为丧失复制能力而停滞在细胞生长周期的某个阶段，最终进入凋亡程序[33]。端粒的长度需要端粒酶的维持，端粒酶是一种核酸蛋白酶，具有延长端粒末端的作用。端粒酶是以其内源性RNA为模板，添加序列到端粒末端，以维持端粒长度，并保持其结构完整。人类端粒酶主要组分包括端粒酶RNA组分(TERC)、端粒酶相关蛋白(TEP)、端粒酶逆转录酶(TERT)3种。

骨髓衰竭尤其是遗传性的骨髓衰竭可能与端粒酶缺陷有关，部分获得性AA患者也存在端粒缩短的现象[34]。近年来有关端粒缩短及端粒酶基因突变与AA之间的关系也是AA发病机制的研究热点之一。Han等[35]对AA患者粒细胞的端粒长度进行研究，发现与同年龄段正常人相比，AA患者端粒长度明显缩短，推测可能与HSC造血功能缺陷有关。Shallis等[36]对AA患者TERT基因进行分析，结果发现其编码端粒酶RNA成分的TERT基因杂合性突变率高于正常对照组，端粒酶活性减低，该基因突变可能是导致AA发生的危险因素。Wang等[36]研究也发现，AA患者HSC的端粒保护蛋白表达明显降低，TERC和TERT基因发生突变，而且这些改变与病情严重程度呈正相关关系。Cui等[37]研究发现，AA患者线粒体基因突变和端粒长度改变存在相关性，且两者与骨髓造血功能衰竭均密切相关。端粒缩短是由于线粒体DNA受损，其功能受到影响所致，进而可影响细胞的分裂复制，最终引起骨髓造血功能衰竭。因此，端粒酶相关基因突变和端粒缩短均可能与AA易感性有关。

4.3 谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因缺乏 GST是一种能够对诱导机体突变物质解毒的亲电子复合物，参与机体中毒物和一些致畸物，如苯及其衍生物等代谢。GSTT1缺乏可导致机体丧失对外界有毒物质或致癌物质的代谢作用，对致畸变物转化能力下降，导致个体易于发生骨髓衰竭。Rehman等[38]对巴基斯坦137例AA患者和220例正常对照组进行研究发现，AA患者GSTM1基因缺陷比例高于正常对照组。因此，GSTT1缺乏或者GSTT1和GSTM1同时缺乏的个体罹患AA的风险更高。该研究GSTT1基因缺乏的AA患者中，部分在确诊时即发现伴有染色体异常；这提示GSTT1基因缺乏人群可能由于外界有毒物质而导致其染色体畸变和不稳定性，从而导致AA易感性升高。

综上所述，AA患者造血微环境中存在BMSCs增殖缓慢、数量减少、特性改变、抑制T淋巴细胞的作用减弱、成脂性增强、细胞凋亡增加，细胞外基质改变，HSC细胞数量减少、凋亡增加、功能异常，HLA基因多态性、端粒酶改变、GST基因缺乏等基因改变。造血微环境对骨髓造血细胞起支持诱导作用，其中的各个成分参与AA的免疫病理过程，与AA的发生发展密切相关，对AA造血微环境的研究有助于揭示其病理机制、指导临床治疗和判断预后。