稀土配位聚合物荧光探针的制备及其对痕量汞离子的检测

张 磊,许 森,赵雅梦，陆鸿宇，于博昊，张维冰

(华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237)

重金属污染，尤其是水的重金属污染严重影响人们的身体健康以及环境生态。重金属的累积效应还会对生物链顶端的生物产生严重威胁[1-2]。重金属汞在人体内累积到一定程度后会沉入肝脏，破坏大脑视力神经，严重影响人们的健康[3]。因此，发展用于Hg2+检测的高灵敏、快速、便捷的检测方法对于环境样品分析具有重要意义。常见的Hg2+检测方法主要有电化学方法[4-6]、电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)[7-9]以及表面增强拉曼光谱法(SERS)[10-12]等。荧光光谱法具有高灵敏度、操作简便、快速和高选择性的优点，近年来被越来越多地用于Hg2+的分析[13-15]。稀土配位聚合物(LnCPs)具有大的Stocks位移，尖锐的荧光发射带和毫秒级的荧光寿命，已成功地用于各种金属离子[16-17]、阴离子[18]的荧光检测。

鸟苷酸(GMP)是人体和动物体的主要核苷酸单磷酸盐，其嘧啶N7和磷酸基团与镧系元素离子之间存在强相互作用，因此广泛用于LnCPs的合成。当GMP与稀土金属铽离子(Tb3+)配位时，能量将从鸟嘌呤基团向Tb3+转移，使Tb3+显示出绿色荧光，基于该能量转移原理，GMP/Tb及其复合材料已被开发为荧光探针，用于葡萄糖氧化酶[19]和碱性磷酸酶[20]传感器。本文以稀土铽离子为发光中心离子，GMP为配体，制备得到能够发射荧光的稀土配位聚合物，将该聚合物与ct-DNA结合使荧光增强，随后基于ct-DNA与重金属Hg2+的相互作用使配合物Tb-GMP-ct-DNA的荧光猝灭，建立了对重金属Hg2+的荧光检测方法。稀土配位聚合物荧光探针对Hg2+的检测示意图如图1所示。首先，以Tb3+为发光中心离子，GMP为配体制备得到具有绿色荧光的稀土配位聚合物(Tb-GMP)。随后加入ct-DNA溶液使荧光强度增强，形成“turn-on”荧光类型的稀土配合物(Tb-GMP-ct-DNA)。最后，利用重金属汞离子与ct-DNA的结合以及与配体GMP的相互作用使荧光猝灭，形成“turn-on-off”类型稀土荧光探针，实现对重金属汞离子的检测。

图1 稀土配位聚合物荧光探针对Hg2+的检测示意图Fig.1 Schematic description of Hg2+detection using terbium phosphonate coordination polymer(Tb-GMP-ct-DNA) as fluorescent probe

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Lumina荧光分光光度仪、Evlution 220紫外分光光度计、Nicolet 6700红外光谱仪(美国Thermo Fisher 公司)；JEM-1400生物透射电子显微镜(日本JEOL公司)；Milli-Q system密理博超纯水仪(美国默克公司)。

六水合硝酸铽(99.9%，斯特里姆化学品公司)；鸟苷-5’-磷酸二钠盐(优级纯，北京百灵威科技有限公司)；小牛胸腺DNA(ct-DNA，优级纯，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、浓盐酸、氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；Hg2+(标准溶液，上海计量测试技术研究院)；实验用水均为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 稀土配位聚合物荧光探针的制备将0.5 mL硝酸铽水溶液(10 mmol·L-1)加入到0.6 mL GMP水溶液(10 mmol·L-1)中，室温振荡反应10 min，得到白色悬浮乳浊液，离心分离(8 000 r/min)5 min，得白色沉淀，用水洗去未反应物，重复3次，得Tb-GMP配合物。将产物分散至1 mL水中，待用。

将不同浓度的ct-DNA加入到2 mL Tb-GMP配合物的悬浮溶液中，室温振荡反应10 min，用Tris-HCl缓冲溶液定容至2.5 mL，得到Tb-GMP-ct-DNA稀土配合聚合物，其最佳制备条件通过荧光光谱进行优化。

在0.5 mL Tb-GMP稀土配位聚合物的悬浮溶液中，加入100 μL ct-DNA溶液(0.141 μmol·L-1)以及不同浓度的Hg2+离子溶液，以Tris-HCl缓冲溶液定容至2.5 mL，利用荧光光谱考察Hg2+对Tb-GMP-ct-DNA的荧光猝灭作用。

1.2.2 荧光光谱测试条件取2.5 mL待测液置于光程为10 mm的石英荧光比色皿中，激发波长为 310 nm，激发波长狭缝宽度5 nm，发射波长狭缝宽度 10 nm，扫描速度1 200 nm/min，扫描范围350～700 nm。

2 结果与讨论

2.1 Tb-GMP-ct-DNA探针制备条件的优化

2.1.1 GMP与Tb3+物质的量之比对荧光强度的影响GMP溶液或者Tb3+溶液的荧光强度很弱或者无荧光信号(图2A)，两者结合后，GMP配体作为天线分子吸收能量并敏化Tb3+，使溶液的荧光信号大大增强。在545 nm发射波长下，随着GMP和Tb物质的量之比逐渐增大，荧光强度逐渐增强(图2B)，当GMP∶Tb的物质的量之比为1.2时，荧光强度达到最大并逐渐稳定。因此，选择GMP∶Tb的物质的量之比1.2作为最佳制备条件。

2.1.2 缓冲盐溶液的影响考察了Tris-HCl、氨水-氯化铵(NH4Cl-NH3·H2O)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、水作为缓冲溶液时对探针制备的影响。结果发现，在545 nm发射波长下，Tb-GMP在Tris-HCl缓冲液(10 mmol·L-1，pH 7.4)中荧光强度最强，在PBS缓冲液(10 mmol·L-1，pH 7.4)中荧光强度最弱。这是因为Tris-HCl缓冲液中Tb3+可以与Tris分子配位，形成Tris-Tb-GMP三元复合物，使得水分子从Tb3+周围释放出来，从而导致Tb-GMP荧光增强。

2.1.3 ct-DNA浓度的影响将不同体积的ct-DNA溶液加入到2 mL Tb-GMP溶液中，以Tris-HCl缓冲盐溶液定容至3 mL，使ct-DNA溶液的终浓度分别为0、0.028、0.141、0.282、0.563、1.127、1.690、2.817 μmol·L-1。室温反应10 min，在310 nm激发波长下检测545 nm处的荧光强度。

在Tb-GMP溶液中，由于Tb、GMP形成双齿配合物，GMP鸟苷部分的敏化作用可以提高鸟苷到Tb3+的能量转移效率，产生4条分别位于490、545、590、630 nm的强发射光谱，依次对应5D4-7F6、5D4-7F5、5D4-7F4、5D4-7F3能级跃迁。如图3A所示，当ct-DNA溶液浓度逐渐增加至0.141 μmol·L-1时，Tb-GMP配合物中Tb3+的多余正电荷与DNA主链上的磷酸根负离子产生静电作用，或与DNA碱基电子给体原子(如O、N)进行配位作用，释放出配合物中的H2O，从而降低了水分子中O—H键振动引起的非辐射能量损失，使得整个体系荧光增强；当ct-DNA溶液浓度继续增加时，除上述静电作用外，双链DNA碱基对之间的氢键在Tb-GMP-ct-DNA体系形成后被弱化，也可能引发DNA双链构象变化，从而阻碍能量向稀土离子的传递，使得整个体系的荧光强度减弱。因此，如图3B所示，0.141 μmol·L-1的ct-DNA为Tb-GMP-ct-DNA稀土配合聚合物的最佳制备浓度。

2.2 Tb-GMP-ct-DNA探针的表征

图5 不同Hg2+浓度下Tb-GMP-ct-DNA 的荧光光谱图Fig.5 The fluorescence spectra of the Tb-GMP-ct-DNA solution with different concentrations of Hg2+

2.3 Hg2+对Tb-GMP-ct-DNA的荧光猝灭

在优化实验条件下，不同浓度的Hg2+溶液对Tb-GMP-ct-DNA的荧光猝灭如图5所示。在Tb-GMP-ct-DNA稀土配合聚合物中，GMP作为天线分子吸收能量并敏化Tb3+，使得Tb3+发生从5D4到7F5的电子能级跃迁，在544 nm处出现较强的发射峰；由于Hg2+不仅与ct-DNA具有较高的结合能力，而且与配体GMP也具有很强的结合能力(结合常数高达K=1026.4)，因此，当向溶液中加入Hg2+时，Tb-GMP-ct-DNA中的Tb3+被Hg2+取代，体系荧光猝灭。在Hg2+质量浓度50～1 200 μg·L-1范围内，体系荧光强度变化程度与Hg2+的质量浓度(C)成正比，线性方程为(I0-I)/I0=0.000 2C+0.010 7，相关系数(r2)为0.991 5，检出限(3δ/slope)为1.5 μg·L-1，相对标准偏差(RSD)为2.3% (C=600 μg/L,n=5)。相比于已有文献(表1)，本方法检出限较低，灵敏度高，操作简便。

表1 水体中汞离子的检测方法Table 1 Analytical methods of mercury ion in water sample

2.4 河水中Hg2+含量的检测

水样中的Hg2+是汞最稳定的无机形式，可以通过微生物甲基化转换成剧毒甲基汞，并通过食物链富集和传递对人体造成损害。本文以河水为实际样品，采用Tb-GMP-ct-DNA稀土配位聚合物荧光探针对Hg2+进行检测。对河水样品进行加标回收实验，每组3次平行，计算得到其回收率为98.1%～99.8%，相对标准偏差为0.28%～1.9%，结果如表2所示。

表2 河水中Hg2+含量的检测及加标回收率Table 2 Determination and recovery of mercury ion in riverwater sample

3 结 论

本文利用硝酸铽、鸟苷酸以及ct-DNA制备了“turn-on-off”类型稀土荧光探针，并利用透射电镜和红外光谱对制备的稀土配合物荧光探针进行结构和形貌表征。基于该探针与重金属汞离子的相互作用，建立了荧光光谱测定重金属汞离子的分析方法。Hg2+质量浓度在50～1 200 μg·L-1范围内与体系荧光强度变化程度呈线性关系，相关系数(r2)为0.991 5，检出限为1.5 μg·L-1，RSD为2.3%。对河水中的Hg2+进行加标回收检测，得到了良好分析结果。本文为环境水中重金属汞离子的检测提供了新的分析方法。