α-硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓内NF-κB表达的影响

檀红玲，梁丹，檀国军，马玉腾，韩梅，高梦颖，张军立

多发性硬化是最为常见的一种中枢神经脱髓鞘疾病，急性活动期中枢神经白质区可见大量炎性脱髓鞘斑，而陈旧病变因胶质纤维增生而形成钙化斑，以多发病灶、缓解—复发病程为特点[1]。α-硫辛酸(α-LA)是一种强效抗氧化剂，近年来，研究发现α-LA还具有抗炎和神经保护作用[2-3]，但具体机制尚不完全清楚。核因子κB(NF-κB)是细胞中广泛存在的转录因子，静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB形成复合物存在于胞浆，经感染、氧化应激、脂多糖等刺激后可活化NF-κB产生多种细胞因子，参与炎性反应[4]。本研究旨在通过检测脊髓中NF-κB及其抑制蛋白IκB的表达，进一步探讨α-LA对自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的可能保护机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：成年雌性Wistar大鼠42只，体质量180～200 g；豚鼠10只，体质量400 g左右，雌雄不限；均购自河北医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(冀)2019-0102，实验动物于SPF级动物房中适应性饲养3 d，自由摄食饮水。(2)试药试剂：α-LA购自香港吉斯恩贝国际贸易有限公司，完全福氏佐剂、4%多聚甲醛、3%甲醇、双氧水、枸橼酸购自上海高创化学科技有限公司，DAB显色试剂盒、NF-κB、IκB抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，山羊血清封闭液、NF-κB、IκB一抗、生物素化二抗购自沈阳万类生物科技有限公司，ELISA试剂盒[白介素(IL)-2、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]购自Cusabio公司。(3)仪器设备：BX51光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，5810离心机(德国艾本德公司)。

1.2 实验方法 2019年1—12月于河北医科大学第二医院神经病学实验室进行实验。

1.2.1 模型建立[5]：豚鼠麻醉状态下，于背部切口取脊髓，小心剔除脊膜和血管，冰浴中将脊髓与生理盐水充分混合制备为50 %(质量/体积)脊髓生理盐水匀浆(GPSCH)，再加入等体积完全福氏佐剂(CFA，含4 mg/ml卡介苗)制成油包水抗原乳剂，完全乳化的标准为取乳化剂滴入清水中不散开。将油包水抗原乳剂注入大鼠四足掌胶质垫内，每只0.4 ml，注射后按压针眼以免乳化剂外漏，建立EAE动物模型。

1.2.2 实验分组：将成年健康雌性Wistar大鼠42只，随机数字表法分为空白对照组(NC组)6只，不予任何处理；36只大鼠用新鲜豚鼠GPSCH诱导免疫，待大鼠发病后随机分为EAE组、α-LA组，每组18只。α-LA组于发病后每日腹腔注射α-LA 100 mg/kg ，1次/d，共注射7 d；EAE组和NC组则每日腹腔注射等体积的生理盐水，共注射7 d。其中EAE组和α-LA组再按发病、缓解、复发3个时点即发病后0 d、、7 d、14 d，每个时间点随机选取6只大鼠观察行为学及病理变化。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 神经功能评分： 每日观察大鼠体质量及精神状态、活动度等进行神经功能评分，采用国际通用的Kono评分标准[6]，其中1分为大鼠尾部无力，2分为大鼠尾部无力+肢体无力，3分为大鼠肢体轻度麻痹，4分为大鼠肢体严重麻痹且被动翻身后不能复原，5分为大鼠处于濒死状态或死亡。

1.3.2 组织病理学观察： 大鼠麻醉状态下，快速取其脊髓腰膨大组织，4%多聚甲醛固定，制备成组织石蜡切片，行改良的三色染色，光学显微镜下观察病理学改变。

1.3.3 NF-κB、IκB检测：制备6 μm的大鼠脊髓腰膨大组织横截面切片，65℃烘烤脱蜡后水化，室温下3%甲醇双氧水孵育20～30 min；采用热修复法，将切片置于适量枸橼酸溶液中沸腾3～5 min；拿出切片放入冷水中冷却，再在切片上滴加山羊血清封闭液，室温下孵育20～30 min；然后在切片上滴加一抗，4℃孵育过夜；次日清洗后在切片上滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min；清洗后在切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育20 min；按照DAB显色试剂盒说明书，进行DAB显色；苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察NF-κB、IκB的表达情况。应用汉化版Image-Pro Plus v 5.1软件(美国Media Cybernetics)进行图像分析[7]，选取阳性表达最强的5个视野进行计算，得出阳性细胞数及阳性细胞显色强度，从而得出免疫组化评分(IHS)的数值。染色评分[8]：以阳性细胞数评分与阳性细胞显色强度评分的乘积为最终得分；阳性细胞数分级：0～1%计0分，1%～10%计1分，10%～50%计2分，50%～80%计3分，80%～100%计4分；阳性细胞显色强度分级：阴性计0分，弱阳性计1分，阳性计2分，强阳性计3分。

1.3.4 血清炎性因子检测： 动物麻醉状态下，采集左心房血2 ml，离心分离上层血清。采用ELISA法检测大鼠血清IL-2、IL-1β和TNF-α的水平。参照ELISA试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况及神经功能评分比较 NC组大鼠精神状况良好，毛发光亮，进食饮水正常，体质量呈缓慢增长；EAE组大鼠免疫后开始出现精神萎靡、毛发不光滑、食欲不振及体质量减轻等，第9天时开始有发病症状：后肢无力和尾部瘫痪，严重时双后肢甚至四肢瘫痪，大小便失禁，处于濒死状态。 α-LA组大鼠免疫后第12 d开始出现上述症状，但症状较EAE组有所改善。与EAE组比较，α-LA组大鼠发病后0、7及14 d时神经功能评分均降低(P<0.01)，见表1。

表1 大鼠发病不同时间点神经功能评分比较分)

2.2 各组大鼠脊髓腰膨大组织病理学变化比较 NC组大鼠脊髓腰膨大组织着色均匀，结构完整，未见明显异常；EAE组出现明显的“袖套样”改变，伴有大量的炎性细胞浸润；α-LA组仍可见大鼠“袖套样”改变和炎性细胞浸润，但病理组织改变较EAE组轻，2组各时期病理组织变化差异不明显，见图1。

2.3 各组大鼠NF-κB和IκB表达比较 与NC组比较，EAE组NF-κB表达水平发病后0 d时较高、7 d时减低、14 d时升高接近0 d时，IκB变化趋势则与之相反；α-LA组发病后0 d时NF-κB表达水平较高，随时间延长呈持续降低趋势，IκB变化趋势则与之相反。与EAE组比较，α-LA组各时期NF-κB表达均降低，IκB表达均升高(P<0.05)，见图2、3及表2。

表2 各组大鼠NF-κB和IκB表达的免疫组化评分比较分)

2.4 各组大鼠血清炎性因子水平比较 EAE组血清IL-2、IL-1β和TNF-α水平发病后0 d时较高、7 d时减低、14 d时升高接近于0 d时， α-LA组发病后0 d时上述因子处于较高水平，随时间延长呈持续降低趋势。与NC组比较，EAE组血清IL-2、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)；与EAE组比较，α-LA组各时点血清炎性因子水平均降低(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

多发性硬化是一种自身免疫性疾病，因其缓解—复发的病程特点，会造成不可逆性神经损伤，严重影响患者生活质量。目前，多发性硬化的治疗以减轻症状为主，缓解时期的治疗围绕降低复发率、延缓疾病的进程展开，缓解期常用药物有干扰素、免疫抑制剂等，但此类药物价格昂贵，且大多会有不同程度的不良反应，影响其临床实用性[9]。因此，开发多发性硬化的治疗药物仍是近年来的研究热点。关于多发性硬化的发病机制尚不完全清楚，但众多研究指出，多发性硬化属于免疫因素介导的炎性反应性病变，而炎性细胞浸润是多发性硬化最具标志性的特征之一[10]。其主要发病机制为：外部因素刺激T细胞的活化，使其进入脑组织分泌大量的炎性细胞因子，进一步促进B细胞和巨噬细胞的活化，并募集外周血中的T淋巴细胞、单核细胞及B淋巴细胞等至反应区域，最终导致中枢神经损伤[11]。NF-κB是重要的核转录因子，可启动细胞炎性反应。Zhang等[12]研究指出，NF-κB通路在EAE大鼠中特异性激活，而敲除NF-κB后EAE大鼠血脑屏障破坏及炎性损伤明显减轻，表明NF-κB参与EAE的发病过程。

α-LA是临床应用广泛且安全性较高的常见药物，主要应用于改善糖尿病患者周围神经病变[13-14]。近年来，大量研究结果显示，α-LA除抗氧化作用外，还兼具抗炎和神经保护的作用[15-16]。Khalili等[17]研究表明，α-LA对多发性硬化患者有较好的疗效，但α-LA的具体保护机制还不清楚。EAE动物模型与人类多发性硬化具有相似的临床、免疫及病理特征。本研究通过对Wistar大鼠注射豚鼠新鲜的脊髓生理盐水匀浆液，成功构建EAE大鼠模型，免疫后的大鼠于第9 d时开始有后肢无力和尾部瘫痪等症状，并具有缓解—复发的发病特点，与文献报道相符[18]。通过评价各组大鼠神经功能评分，发现对于EAE大鼠缓解和复发时期，α-LA均可明显减轻大鼠神经功能损伤，改善脊髓腰膨大组织病理学变化，与Waslo等[19]研究结果相符。NF-κB在自身免疫功能中有重要作用，正常状态下NF-κB与其抑制蛋白IκB结合形成复合物存在于胞浆中，胞外刺激可降解IκB而激活NF-κB，后者以二聚体形式进入胞核介导炎性反应。本研究结果显示，NF-κB/IκB及相关炎性因子(IL-2、IL-1β及TNF-α)水平在EAE大鼠中的表达与其病情紧密相关，发病高峰期NF-κB及炎性因子表达高，缓解期表达降低，而复发期又升高，IκB的表达趋势则与之相反，进一步验证了NF-κB介导炎性反应参与疾病的发生发展。EAE大鼠经α-LA处理后，各时期NF-κB和炎性因子的表达明显降低，IκB的表达明显升高，说明α-LA通过调控NF-κB/IκB的表达，在EAE大鼠中发挥抗炎作用，保护大鼠神经损伤，这与Zhang等[20]报道α-LA可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，发挥抗炎作用相符。

注：箭头指示“袖套样”改变和炎性细胞浸润

图2 各组大鼠脊髓腰膨大组织中NF-κB表达情况(DAB染色，×400)

图3 各组大鼠脊髓腰膨大组织中IκB表达情况(DAB染色，×400)

表3 各组大鼠不同时点血清炎性因子水平比较

综上所述，α-硫辛酸可明显减轻EAE大鼠神经损伤，其抗炎机制可能与下调NF-κB表达，并上调IκB表达有关，后期将深入探讨α-硫辛酸在EAE大鼠中的抗炎作用机制，为α-硫辛酸用于多发性硬化的临床治疗提供参考。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

檀红玲、梁丹：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；檀国军：课题设计；马玉腾：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;韩梅、高梦颖：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;张军立：进行统计学分析