角蛋白7在膀胱癌中的表达及与临床预后的关系

徐长阳，刘敏，刘鹏，郎根强

膀胱癌属于泌尿系统恶性肿瘤，大数据显示，在危害人类健康全身恶性肿瘤中，男性膀胱癌发病率排在第7位，女性膀胱癌排在第10位之后[1]。临床研究显示，膀胱癌患者术后3年生存率为15%～30%，多数患者死于癌症复发或癌细胞远处转移[2-3]。近年来，分子靶向治疗取得快速的发展，寻找新的治疗方向是临床和学术界关注的热点。细胞角蛋白(KRT)是一种中间丝，存在于许多上皮细胞或部分非上皮细胞。角蛋白7(keratin 7，KRT7)属于细胞角蛋白家族，可参与细胞间连接的形成，维持上皮细胞的完整性[4]。有研究显示，KRT7表达于导管上皮细胞和尿路上皮细胞、已分化的尿路上皮细胞，对肿瘤的预后评估具有一定的价值[5]。已有研究报道膀胱癌组织中KRT7表达水平明显低于正常组织[6]。本研究采用免疫组化法检测KRT7在膀胱癌组织中的表达及其与膀胱癌预后的关系，旨在明确KRT7在膀胱癌中的作用及评估患者预后方面的价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年6月—2017年4月上海长海医院虹口院区泌尿外科手术切除的100例膀胱癌患者组织标本为研究对象，并选取相应的距病灶组织3 cm处100份癌旁组织为对照组。男65例，女35例；年龄35～77(55.87±10.86)岁；病程8～24(16.04±4.46)月。膀胱癌的临床表现为尿频、尿急、尿痛、肉眼可见的间歇性血尿[7]。按照国际抗癌联盟(UICC)的临床TNM分期[8]：非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)54例，肌层浸润性膀胱癌(MIBC)46例；按照WHO病理分级[9]：低度恶性倾向14例，高分化33例，低分化53例；有淋巴结转移63例，无淋巴结转移37例；病理类型为膀胱尿路上皮癌40例，膀胱鳞状上皮癌36例，膀胱腺癌24例；合并膀胱结石30例，合并排尿不畅26例。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者及直系亲属对本研究知情同意，并签订临床研究协议书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①患者术前未接受任何辅助性治疗；②患者临床资料完整，能够接受术后随访；③患者为首次患膀胱癌。(2)排除标准：①肝、肾功能异常患者；②并发其他恶性肿瘤、有膀胱癌家族遗传史患者；③曾经接受过放化疗患者；④合并有其他泌尿系统疾病患者；⑤有吸烟、酗酒史。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 KRT7表达水平检测：采用免疫组化法检测组织中KRT7表达水平。标本经石蜡包埋后，采用RM2016型轮转式切片机(德国徕卡公司)连续切6片，厚度3～4 μm，编码并烘干(60℃，2 h)。采用苏木精浅染，自来水冲洗还蓝，烘干后经二甲苯脱蜡，依次用75%、85%、95%、无水乙醇进行梯度洗脱、脱水干燥，加入鼠抗人KRT7抗体(上海钰博生物科技有限公司)作为一抗，4℃冰箱过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，滴加羊抗鼠二抗(北京博尔西科技有限公司)，25℃孵育24 h，用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。最后用中性树胶封固。SPCC-200型生物显微镜(东莞市谱标实验器材科技有限公司)下观察摄片。PBS代替一抗作为空白对照。每个实验结果由3位专业人员独立判断评定。KRT7表达于胞浆，阳性表达呈浅棕色或深棕色。根据细胞染色强度，阳性强度评分：样品无色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。任意选择3个高倍(×200)光学显微镜下视野阳性细胞百分比进行计分，评分标准：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。根据染色指数(SI，即染色强度与阳性细胞所占比例的评分乘积)大小将免疫组化结果进行等级划分：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。其中阴性记为KRT7阴性，弱阳性、阳性和强阳性记为KRT7阳性。

1.3.2 随访情况：所有膀胱癌患者治疗后均接受常规随访，随访时间36个月，术后第1年每隔3个月患者入院复查1次，术后第2、3年，每隔6个月患者入院复查1次，并每2个月电话随访患者，记录膀胱癌患者复发、肿瘤转移及生存死亡情况。本次随访截止日期2020年4月。

2 结 果

2.1 膀胱癌组织和癌旁组织KRT7表达水平比较 膀胱癌组织KRT7阳性表达率为67.0%(67/100)，低于癌旁组织的92.0%(92/100)(χ2=19.175，P=0.000)，见图1。

2.2 膀胱癌不同临床病理特征患者中KRT7表达水平比较 膀胱癌组织中KRT7表达水平在不同性别、年龄、病理类型中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，在不同TNM分期、病理分级及淋巴结转移中比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 膀胱癌旁组织和膀胱癌组织KRT7表达情况(HE染色，×200)

2.3 膀胱癌组织KRT7阳性、阴性表达患者生存率比较 Kaplan-Meier法分析显示，KRT7阳性膀胱癌患者平均生存时间为30.85个月，长于KRT7阴性膀胱癌患者(17.65个月)，Log-rank检验值χ2=36.928，P=0.000，见图2。

2.4 影响膀胱癌患者预后的危险因素分析 多因素分析结果表明，TNM分期MIBC、有淋巴结转移、KRT7阴性是影响膀胱癌患者不良预后的独立危险因素(P均<0.05)，见表2。

图2 膀胱癌组织KRT7不同表达水平患者生存率比较

表2 影响膀胱癌患者预后的危险因素分析

3 讨 论

膀胱癌以尿路上皮细胞癌最常见，占膀胱癌的90%以上。尽管生活水平及医疗水平均有所提高，但膀胱癌的发病率仍然逐年增加，且趋于年轻化[10-12]。临床上大多数膀胱癌患者初诊时为非肌层浸润膀胱癌，在治疗过程中，癌症复发和癌细胞转移是影响膀胱癌预后的关键因素[13-14]。因此，为提高膀胱癌患者治愈率及生存率，及早监测膀胱癌术后病情是有效的预防手段之一。

表1 KRT7表达水平在膀胱癌不同临床病理特征中比较 [例(%)]

角蛋白家族包括Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白，是上皮细胞中间丝的构成蛋白，也是细胞骨架不可缺少的部分，在细胞中起着结缔支持和保护的作用，参与癌症的发生发展[15-16]。在尿路上皮细胞癌变的过程中，角蛋白的表达通常较为保守。有研究显示，角蛋白19可介导尿路上皮细胞间质转化信号传导通路[17]。KRT7位于12号染色体上，编码469个氨基酸残基，表达于上皮组织分化期异型角蛋白链，胞质内的KRT7与其他辅助蛋白结合后，在维护上皮细胞的形态完整性上具有重要作用。KRT7属于小分子量角蛋白，在上皮细胞肿瘤中的表达具有特异性[18]。已有文献显示，KRT7在宫颈上皮细胞中具有特异性表达[19]。KRT7能够调控DNA复制、细胞周期及基因表达等[20]。肿瘤的发生是正常染色体多重损伤后发生的结果，包括抑癌基因的失活、原癌基因的过度激活、DNA转录失常等，由此推论KRT7可能参与肿瘤发生的调节[21-23]。田向永等[6]研究发现，KRT7的水平随肿瘤分期及病理分级的增高而降低，表明KRT7低表达可能有较高的膀胱癌复发及转移。本研究发现，膀胱癌组织KRT7阳性表达率显著低于癌旁组织，提示KRT7可能与膀胱癌发生有关。膀胱癌主要按肿瘤浸润深度来分期，也是膀胱癌预后的重要参考指标，其中肿瘤生长未达到肌层的表浅膀胱癌，占膀胱癌的75%～85%，而肌层浸润膀胱癌占15%～25%，膀胱癌的病理分级也是预后的重要指标，其中高分化的癌细胞分化良好，侵袭性不强；低分化的癌细胞分化差，侵袭性较强，患者预后也较差。本研究发现，KRT7与TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关，可能是通过调节机体染色体活性，从而影响膀胱癌患者病情。本研究术后随访发现，KRT7阳性膀胱癌患者平均生存时间显著长于KRT7阴性膀胱癌患者，TNM分期MIBC、有淋巴结转移、KRT7阴性是影响膀胱癌患者不良预后的独立危险因素，提示KRT7阴性患者可能易发生肿瘤复发，对该部分患者在治疗和术后恢复中应给予更多的关注。

综上所述，KRT7在膀胱癌组织中阳性表达率显著降低，与患者TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关，有望成为膀胱癌预后的监测指标，KRT7阴性表达者、TNM分期为MIBC和有淋巴结转移的患者，在临床治疗时应更多注意患者的病情。但KRT7参与膀胱癌发生发展的机制有待进一步探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

徐长阳：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；刘敏：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；刘鹏：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；郎根强：进行统计学分析