黑龙江省某牛场多种病原混合感染病例的实验室诊断

王浩先，王世界，王祥玉，倪宏波

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163000； 2.青岛农业大学动物医学院)

近年来，牛病的种类相对增多，且发展趋势向着疑难杂症转变[1-2]，其中以牛的呼吸道、胃肠道疾病为典型，往往也是最易造成牛的死亡，其极高的发病率，也为牛场带来了严重的经济损失[3]。

本实验根据黑龙江省杜蒙乌力吉图某奶牛场的流行病学调查和送检的2份病料进行PCR病原鉴定和细菌分离鉴定，在此基础上进行了药敏试验。现将诊断过程及结果总结如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 乌力吉图奶牛场送检的2份从心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、各处黏膜采集的样本存放于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2实验方法

1.2.1样本的处理 取每个组织样本1 g混合于玻璃研磨器中，加入DEPC水2 mL，研磨至样本均匀。倒出研磨液，稀释至肉粉色(或无明显血液)达到合理浓度。

用同样方法取每个组织样本1 g于玻璃研磨器中用生理盐水稀释一遍做细菌培养试验。

1.2.2细菌分离培养 将处理后的两份样本在血琼脂平板上进行划线培养(37 ℃,24 h)，观察细菌菌落生长情况，随后涂板进行药敏实验。

1.2.3药敏实验 挑取细菌菌落用生理盐水制成菌液均匀涂于血平板上，用上述药片进行药敏实验。

1.2.4菌样样本DNA/RNA的提取 提取菌样样本DNA采用天根(TIANGEN)TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。

提取菌样样本RNA采用天根(TIANGEN)RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(离心柱型)。

依据DNA/RNA提取试剂盒使用说明书按步骤进行操作提取所需菌样样本DNA及RNA。

1.2.5十三对PCR引物及其反应条件 各病原各自对应的引物序列及退火温度如表1所示。其所需的反应条件及其所需的反应参数如表2所示。

表1 十三对PCR引物及其反应条件

表2 PCR反应程序

2 结果

2.1药敏实验结果 药敏试验结果显示：1号病料样本对盐酸林可霉素敏感，对链霉素、恩诺沙星中度敏感，对硫酸庆大霉素有耐药性；2号病料样本对链霉素敏感，对盐酸林可霉素、恩诺沙星中度敏感对氟苯尼考有耐药性，详细结果如表3所示。

表3 药敏试验结果

2.2SS鉴别培养基实验结果 如图1所示，经SS琼脂培养基培养鉴定，培养鉴定出粉红色大肠杆菌菌落，无黑色沙门氏菌菌落。

2.3PCR实验结果 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像分析仪摄像核酸电泳凝胶成像，其结果如图2所示。1号病料样本检测出的致病病原为：魏氏梭菌α、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏杆菌病、多杀性巴氏杆菌、牛化脓隐秘杆菌、牛冠状病毒和牛轮状病毒。2号病料样本检测出的致病病原为、魏氏梭菌α、牛传染性鼻气管炎、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏杆菌病、多杀性巴氏杆菌和牛化脓隐秘杆菌，详细结果如表4所示。

图1 SS琼脂培养基鉴定

注：M代表marker，M左侧1-13为1号混合病料检测；右侧1-13为2号混合病料检测。图2 两份病料PCR结果图

表4 PCR结果表

3 讨论

本实验通过检测两例混合病料检出：1号病料其主要致病病原为大肠杆菌、魏氏梭菌α、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏杆菌病、多杀性巴氏杆菌、牛化脓隐秘杆菌、牛冠状病毒和牛轮状病毒。2号病料其主要致病病原为大肠杆菌、魏氏梭菌α、牛传染性鼻气管炎、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏杆菌病、多杀性巴氏杆菌和牛化脓隐秘杆菌。

药敏实验结果表明1号样本对盐酸林可霉素敏感，对链霉素、恩诺沙星中度敏感，对硫酸庆大霉素有耐药性；2号样本对链霉素敏感，对盐酸林可霉素、恩诺沙星中度敏感对氟苯尼考有耐药性。分离出的细菌主要是条件致病菌和环境致病菌，因此要保持牛场环境的污染小，并减少外界环境对牛的刺激，以免应激后增加发病率。当本牛场出现以呼吸道和消化道疾病为主要特征的病例时，可首选链霉素和盐酸林可霉素作为治疗药物，并采取隔离措施，对类似情况有一定指导意义。由于耐药性的存在，在治疗中应使用多种敏感药物联合或交替使用，以减少单一药物的剂量或使用时间以达到更好的治疗效果[4-6]。

近几年国内外牛呼吸系统疾病频发，有国外的学者将由支原体和多种细菌或病毒引起的牛肺炎、支气管炎、运输热等统称为牛呼吸道疾病综合征，该类病症会对牛养殖业造成巨大的经济损失，因此我国采取了重大动物疫病强制免疫措施，以从源头上预防并控制疾病，且已经取得了不错的效果。由此可见现阶段对细菌性病原的致病机理和防控技术研究具有重大意义[7-9]。

本病例虽未检出牛腹泻黏膜病毒，但牛病毒性腹泻病在牛群养殖的过程中常见，且极易流行，各个年龄段的牛都容易受此病毒的感染，特别是犊牛，一旦发作便会导致急性牛病，临床特征常以发热且严重腹泻，并且其排泄物当中都含有此类病毒，因此牛舍的环境对该病的传染有十分巨大的影响，要做到及时清洁保持牛舍的比较干净、干燥舒适的环境[10-12]。