巴雷特食管演变为食管腺癌的研究进展

姚莉雯（综述），许树长（审校）

同济大学附属同济医院消化科，上海200065

巴雷特食管（Barrett esophagus，BE）是指食管下段的正常复层鳞状上皮被化生的柱状上皮所取代，其化生包括胃底上皮样化生、贲门上皮样化生以及特殊肠型化生。其中肠上皮化生是发展为食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）最重要的病理改变。而从BE到EAC的演变和进展成了BE的研究焦点。

1 BE癌变过程中的重要信号分子

1.1 p53抑癌基因

p53基因又称为TP53，迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，调节各种各样基因的表达，包括细胞凋亡、生长抑制、抑制细胞周期进程、分化和加速DNA修复、基因毒性和细胞应激后的衰老等。该基因编码一种相对分子质量为53 000的蛋白质［1］。p53的突变灭活可以导致无异型的BE向高度不典型增生发展［2］。通过比较有无进展的食管高度不典型增生和腺癌的患者组织发现，有进展的患者组织中的p53突变率明显升高［3］。一项基因表达谱数据的meta分析提示，TP53和CDKN2A在两种EAC亚型中均发生了显着突变［4］。p53突变符合良好风险分层候选标记的标准，因为TP53突变可区分是否患有高度不典型增生，这是治疗干预的重点。一项回顾性研究认为p53表达可预测BE患者中进展为晚期肿瘤的可能［5］。

p53突变的等位基因部分差异很大［2］，但是突变主要集中在DNA结合域中，这些突变主要是通过错误的变异，抑制p53蛋白与DNA的结合，从而抑制p53依赖的转录。携带p53基因的17p染色体的高频的杂合性损失（loss of heterozygosity，LOH），可能成为BE肿瘤进展的生物标志物的新热点［6］。在肿瘤发生的早期，p53蛋白的活性也受到非突变机制的抑制。在酸反流条件下，野生型p53蛋白具有明显的抑制作用。一项研究［7］发现，一种机制阐述了p53蛋白加合物的形成：胃食管反流会产生反应性的异列乌甘素，由自由基诱导的脂质过氧化和COX2酶产生的γ-酮醛家族，在p53分子上形成加合物，从而抑制p53的活性和蛋白质沉淀。

1.2 受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RPTKs）

RPTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RPTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性的细胞内结构域。RPTKs是许多多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和性细胞表面受体。在人类基因组中鉴定的90种独特的酪氨酸激酶基因中，有58种编码RPTKs蛋白。RPTKs不仅被证明是正常细胞过程的关键调节因子，而且还在许多类型的癌症的发展和恶化中起关键作用。

表皮生长因子受体（EGFR）、ERBB2/HER2、胰岛素样生长因子受体1（IGF1R）、肝细胞生长因子受体（HGFR/c-MET）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）等一大类PTK在EAC的发生发展中起着重要作用［8］。异常的EGFR信号转导的激活是由EGFR蛋白及其配体TGF-α和EGF的过量产生引起的。在22.2%～35%的BE和46.5%～80%的EAC患者中发现EGFR蛋白表达增加。有研究称，EGFR表达与EAC患者生存率低下相关。体外研究发现，用酸性胆盐处理食管细胞可以激活EGFR信号。除EGFR外，EGFR家族另一成员ERRB2/HER2的蛋白表达在食管异型增生和肿瘤中也明显增加。

肥胖为EAC的高危因素，诸多肥胖相关的癌变被认为是通过胰岛素和胰岛素样生长因子（IGF）家族的增殖作用来介导的。EAC中IGF1R通路也被强激活，43.2%的BE和70%的EAC患者中发现了磷酸化胰岛素受体底物1（pIRS1）染色增强，该底物可从IGFR受体传递信号。BE患者血清中IGF-1配体水平升高。另一种酪氨酸激酶受体c-MET由肝细胞生长因子调节（HGF），在BE和EAC中高度诱导。c-Met免疫反应在100%的异常增生的BE和EAC患者中发现，并与预后不良相关。激活MET可以诱导EAC中β-连环蛋白。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号转导在血管内皮细胞中也增加，并在BE和EAC中调节血管生成。BE和肿瘤细胞都产生VEGF蛋白，其表达与食管血管形成相关。在VEGF成员中家族，VEGF-A，VEGF-C的表达在从BE向EAC的发展过程中增加，并提示与转移和晚期疾病相关。其中，RAS和PI3K在EAC中经常发生改变。一些研究报道了K-RAS激活突变和KRAS的扩增基因。在60%的EACs中，RAS下游的中枢效应通路（ERK/MAPK）被激活。类似地，丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，作用于PI3K途径，在大约80%的高度不典型增生和EAC中被磷酸化和激活。低度发育不良病例均未显示出强烈的p-Akt染色，而在部分化生的BE黏膜中仅观察到弱的p-Akt活性，Akt在由BE引起的高度发育不良和EAC中被高度激活。这些发现表明p-Akt在BE发展为EAC中的作用。反流被认为是PI3K-Akt和ERK/MAPK通路激活的原因。

1.3 细胞周期调控

20多年前，D型细胞周期蛋白，其细胞周期蛋白D依赖激酶（CDK4和CDK6）以及多肽CDK4/6抑制剂p16（INK4）的生化和遗传特性揭示了哺乳动物细胞如何调节进入DNA合成的过程细胞周期控制途径。D型细胞周期蛋白，CDK4/6-PRB的失调在大多数癌症中均有报道，这包括细胞周期蛋白的过表达（尤其是D1和E1）和CDK抑制剂（INK4A，INK4B和KIP1）和pRB的丧失。CDK6是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其活性依赖于与D型细胞周期蛋白的结合（Cycin D1，D2和D3）和CDK4，它磷酸化并抑制pRB肿瘤抑制因子，使细胞周期在停滞有丝分裂的G1期早期。携带CDK6基因的7q21在35%的EAC中被发现，CDK4基因的扩增程度较小，约10%［9］。两种基因的扩增均与EAC患者生存不良有关。

多细胞周期调控因子在EAC中受到影响，其中包括由CDKN2A基因编码的肿瘤抑制因子p16INK4a和p14ARF。p16INK4a是细胞周期蛋白D/CDK4/6复合物的特异性抑制剂。它的抑制导致正常细胞周期的中断和不受控制的细胞增长。免疫组化染色显示，20%～68%的BE和60%～100%的EAC病 例 中，p16INK4a表 达 缺 失。p14ARF在20%的BE和75%的EAC的病例中下调。值得注意的是，p14ARF的下调干扰了p53的正常表达应答，因为p14ARF是p53的关键上游调节因子通过阻断Mdm2介导的降解激活TP53。

另一种CDK抑制剂p27KIP1，通过抑制细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白D/CDK4复合物来调节细胞周期，在BE和EAC中也受到影响。30%～70%的BE和83%～100%的EAC病例中发现p27 KIP1蛋白低水平表达，并且与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和生存率相关［10］。有研究将p27KIP1基因敲除的小鼠经行食管造口术，遂发生BE和EAC。

此外，EAC的特点是上调了几个周期蛋白。在25%～38%的BE和36%～44%的EAC患者中，细胞周期蛋白D1被上调。细胞周期蛋白D1的表达增加具有预后意义，并与EAC患者的低生存率相关。高细胞周期蛋白D1的表达可能反映了BE相关癌变过程中的早期事件。另一种细胞周期蛋白cyclin E的蛋白表达在从非异常增生性食管癌到高度异常增生的过程中显著增加，5.8%的BE、19.0%的低度不典型增生、35.7%的高度不典型增生和16.7%的EAC的病例中均有高表达。同样的研究发现，在19.0%的EAC病例中，编码细胞周期蛋白E1的CCNE1基因扩增。

1.4 衰老相关基因（Sirt1）

高龄已被证明是食管肿瘤独立的预后不良因素之一。Sirt1是一种新近发现的与衰老相关的组蛋白脱乙酰酶，参与调控通过多种亚细胞分子（如p53、叉头转录因子、PGC-1α、NF-κB、Ku70和组蛋白）的去乙酰化来实现应激反应、营养代谢和衰老的多个关键步骤［11］。越来越多的证据提示Sirt1在肿瘤发生中起着复杂的作用。有研究使用组织芯片和免疫组化方法研究中国人近端胃癌（包括GEJ癌）中Sirt1基因的表达。研究提出与正常对照组相比，Sirt1基因在GEJ癌的一个亚组中表达显著增高，与淋巴结转移显著相关，病理分期高，生存预后差，1年和3年生存率显著降低（80%和49%），提示该分子对该癌症患者的预后有预测价值。

1.5 环氧合酶-2（COX-2）

环氧合酶-2（COX-2）蛋白催化类前列腺的形成，有助于各种组织的炎症和肿瘤的发生，在一半以上的BE和EAC患者中明显上调。自抑制COX-2活性以来抑制炎症和诱导凋亡，COX2被认为是食管癌预防和治疗的靶点，并以其在正常肠道发育过程中的作用而闻名。酸和胆汁在体外和体内强烈刺激COX2上调，促进有助于BE的发展。有学者研究了接受食管胃十二指肠吻合术的大鼠，发现其出现慢性食管炎，伴有食管血流下降和表皮生长因子（EGF），COX-2和TNF-α的黏膜表达增加，外源性EGF加剧了这些作用，从而提出在慢性食管炎发展为BE和EAC的发病机制中，EGF/EGFR，PG/COX-2和具有PPARγ途径的促炎细胞因子之间的相互影响［12］。

2 BE癌变过程中的重要信号通路

2.1 转化生长因子β（TGF-β）通路

转化生长因子-β（TGF-β）调节细胞的生长和分化，凋亡，细胞运动，细胞外基质的产生，血管生成和细胞免疫。它在癌症中具有矛盾的作用。在早期阶段，它抑制细胞转化并防止癌症进展。在后期，TGF-β主要通过以下三种机制在促进肿瘤进展中起关键作用：促进上皮向间充质转变，刺激血管生成和诱导免疫抑制［13］。研究表明，与正常鳞状上皮相比，BE中TGF-βmRNA水平没有变化或下降［14］。但在EAC的晚期阶段，TGF-β的表达显著增加。EAC还表现为TGF-β相关蛋白BMP4和激活素A的高表达，这些蛋白被认为能促进侵袭性表型。接触胆盐会引起BMP4和TGF-β1。相反，TGF-β信号传感器（SMAD）通常在EACs中丢失，其中，SMAD2和SMAD4的影响最大。30%～70%的EAC患者存在SMAD2/4表达缺失。在BE和EAC中TGF-β受体2的表达也被下调，导致TGF-β信号转导失调。

2.2 Hedgehog（Hh）通路

Hedgehog（Hh）信号分子是一种由信号细胞所分泌的局域性蛋白质配体，作用范围很小，一般不超过20个细胞。Hedgehog信号通路控制细胞命运、增殖与分化，该信号通路被异常激活时，会引起肿瘤的发生与发展。Hh信号通路对正常肠道发育至关重要，也有助于食管上皮肠化生的进展。Hh通路信号通过Hh配体与其跨膜受体“修补”（PTCH）结合而激活。在没有配体结合的情况下，PTCH会抑制信号传感器平滑（Smo）蛋白质，配体结合后，SMO从PTCH抑制中释放出来，激活Gli转录因子调节下游靶基因。已有研究表明，正常食管上皮中的Hh信号转导受到抑制，它在BE中被强烈激活，这可能是由于反流引起的。在96%的EAC患者中发现了调节Hh途径的蛋白的强染色，大约90%的EAC患者也显示了Gli1和Gli2蛋白的异常表达。食管鳞癌中这些蛋白质的水平较低。最近在BE和EAC中上调的Shh靶蛋白中发现了FOXA2蛋白。这种转录因子被认为有助于BE的发展。Shh信号也可能通过诱导BMP4和SOX9而促进BE的发展。Wang等［15］通过研究食管鳞状细胞系和鳞状组织在体外暴露于酸和胆汁盐或胃食管反流在体内表现，证实在食管鳞状细胞系中，Hh信号转导诱导决定鳞状上皮物表型的基因表达，从而促进BE发生。在反流性食管炎、BE化生和食管腺癌的大鼠手术模型中，用SMO抑制剂治疗18周后显著降低了BE和EAC的发病率，支持Hh通路抑制在GERD患者中防止Barrett化生的作用［16］。

2.3 Notch信号通路

Notch信号通路涉及正常发育和疾病的不同方面，从干细胞调节和组织形态发生到癌症和其他疾病。从机制上讲，Notch信号是由一组Notch受体介导的，这些受体由各种配体调节，如Delta样和锯齿状配体。配体的结合导致受体发生一系列蛋白水解裂解，释放Notch胞内结构域（NICD），NICD转移到细胞核并激活多个靶基因的转录。在食管中，Notch信号在基底上皮上活跃，其抑制作用通过KLF4依赖机制促进BE的发展。反流可能在这个过程中起作用。与BE相反，EAC在72%的EAC病例中显示NICD的诱导。Notch活性升高与EAC的分化状态和临床分期有关。EAC患者中JAG1/2、DDL1/3/4配体和Notch靶点Hes-1、EY1/2、NEYL的水平也增加。

2.4 Wnt信号通路

Wnt信号Wnt/β-catenin信号异常激活是常见于BE肿瘤转化，是肿瘤进展的基础。在LGD、HGD和EAC中，β-catenin在细胞核中有较强的表达；而β-catenin的核表达在正常食管组织和Barret的化生中是罕见的，即使在BE中β-catenin的激活但没有核聚积。在与结肠和其他肿瘤相比，Wnt/β-catenin途 径 的 失 调 很 少 是 由APC、AXIN1、CDH1或βcatenin基因突变引起的；在EAC中常常出现WNT2的上调、WNT抑制因子1（WIF1）的丢失以及sFRP1（分泌的Frizzled相关蛋白1）和APC基因的启动子高甲基化。但进一步的作用相关受体，目前研究较少。有Wnt信号相关受体体外研究显示EAC细胞中Fzd2，Fzd3，Fzd4，Fzd5，Fzd7和共受体LRP5/6的最高表达［17］。HGF和TNFα也可诱导食管细胞βcatenin的核积聚。Ki67作为Wnt靶基因，上调也与高度不典型增生有关。

3 BE癌变过程中的其他机制

3.1 线粒体变化

线粒体和线粒体DNA的改变已被证明与各种癌症，包括食管癌有关。已经发现线粒体对氧化应激的反应，线粒体代谢的改变，线粒体膜电位的变化和线粒体遗传突变与BE的发病机制有关［18］。有研究［19］提出，线粒体能量代谢在整个化生-异型增生-腺癌序列中有差异，并且氧化磷酸化谱在将Barrett的非进展者和进展者分离为腺癌中具有预测价值。在体外巴雷特病序列中，三个能量代谢基因（ATP12A，COX4I2，COX8C）发生了显着改变。整个Barrett序列的体内验证证明了这些基因的差异表达。组织芯片显示了体内Barrett序列的上皮和间质氧化磷酸化（ATP5B和Hsp60）和糖酵解（PKM2和GAPDH）蛋白标记都有显着变化。

3.2 自噬

自噬是一种主要的生理溶酶体依赖性机制，可降解和回收细胞蛋白和细胞器，Beclin-1在自噬的调节中起着核心作用。Beclin-1在鳞状上皮和非异型增生BE中高表达，而在异型增生BE和EAC中低表达。研究表明，长期暴露于胆汁酸不会影响Beclin-1的表达，因此会导致自噬缺陷。

Barrett癌变的相关机制复杂，涉及多种基因，饮食、行为和环境因素。当前接受的研究模式是GERD导致组织损伤和BE的发展，继而发展为食管癌和浸润性癌，强调了EAC的发展由反流引起的DNA持续损伤促进了基因组多种抑癌基因的不稳定性，继而引起各信号通路作用引起。在过去的二十年里，在发展中关键信号分子和途径的定义EAC的选择与进展，利用生物标志物来预测进展的风险也得到了广泛的研究。其中一些候选标志包括p53表达、荧光原位杂交（FISH）检测到的染色体拷贝数变化、甲基化DNA标志以及其他的上皮和间质分子标志，得到研究。这些生物标志物的研究目的是确定低风险和高风险组，进行定期监测随访（低风险组）、强化监测或主动消融（高风险组）的分层管理。新技术的发展有助于为了更好地从分子和细胞基础研究癌症，有助于对患者进行分层治疗［20］。然而，许多关于反流诱导机制的问题，如各信号通路之间的关联，细胞损伤与各种信号网络间的相互作用仍然没有答案，需要进一步的研究解决这些难点，帮助识别新的分子靶点用于EAC诊断与治疗。