苦参有效部位对人参黑斑病菌的抑菌研究

王彩云 陆承双 常丰华

摘 要 采用超声波提取工艺获取苦参总生物碱，用药物二倍稀释法与菌落抑制率公式观察计算苦参总生物碱对人参黑斑病菌的抑菌作用，并测定用药时的抑菌浓度范围;同时采用孢子萌发法和生长速率法，对苦参中总黄酮提取物对人参黑斑病菌的抑制效果进行研究。实验结果表明：不同苦参总生物碱浓度对人参黑斑病菌丝和孢子均具有抑制作用，在苦参总生物碱浓度为10 mg·mL-1及以上时与空白对照组相比，对人参黑斑病菌丝的抑制率为98.8%，孢子的抑制率为100%。苦参总黄酮溶液含量达到0.1 g·mL-1（10%）时，抑菌效果最佳。

关键词 苦参;总生物碱;总黄酮;人参黑斑病

中图分类号：R284.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.29.076

苦参为豆科植物苦参（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，味极苦。其主要药用成分为苦参碱和氧化苦参碱[1]，其重要化学成分还有黄酮类[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

人参黑斑病菌从吉林农业科技学院人参种植基地患有黑斑病的人参叶片上培养分离取得。

培养基为PDA培养基（用于制药敏琼脂培养基，承接分离纯化的黑斑病菌和盛放不同浓度的苦参总黄酮溶液）。

1.1.2 实验仪器

超声波提取机、鼓风干燥箱、精密恒温水浴锅、医用离心机、循环水式多用真空泵、密封型手提式粉碎机、万分之一电子天平、生物显微镜、冷藏柜、隔水式电热恒温培养箱、手提式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、旋转蒸发仪。

1.2 试验方法

1.2.1 苦参总生物碱的提取

取苦参根部，洗净晒干，切片粉碎，称取100 g粉末，苦参药材粗粉以10倍量的0.2%盐酸溶液进行超声波提取，控制提取条件为时间40 min，功率500 W[3-4]。提取液用纱布初过滤后，取得滤液，在离心转速为3 000 r·min-1的离心机上离心5 min后，取得上清液，在上清液中加入3%的氢氧化钠，调pH值为8.5[5]，静置，析出沉淀，干燥备用。

1.2.2 苦参总黄酮提取及溶液的制备

用粉碎机将苦参饮片粉碎，得苦参细粉，并称取50 g，用滤纸将其包好放置于索式提取器的提取管中，再向烧瓶中加入95%的乙醇溶液，通冷凝水，加热回流，连续提取6 h，用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩[6]，然后使用柱层析法对浓缩液中的总黄酮进行分离[7]，得到较纯的苦参总黄酮溶液，再使用95%的乙醇对分离得到的总黄酮溶液进行定容，使溶液浓度为5 g·mL-1，最后将溶液分装于10 mL具塞试管中，密封，置于4 ℃的冰箱内保存，备用。

1.2.3 人参黑斑病菌的分离与培养

1）取高温灭菌后的培养皿，在超净工作台中倒入已灭菌的PDA培养基20 mm，待冷凝后制作成平板，放入冷藏柜备用。

2）采集人参种植基地出现黑斑病病斑的人参叶片，用流水冲洗数遍。于无菌环境下，切下带有人参黑斑病菌的病斑叶片数块，并把病斑叶片放入70%乙醇溶液中消毒2～3 s，再放入0.1%的升汞溶液中消毒30 s，最后用无菌水冲洗数次，并用灭菌后的吸水纸除去叶片上的水分，减少细菌滋生。将叶片置于PDA培养基平板上，每个PDA培养基平板放4～6块，然后把培养皿倒置于电热恒温培养箱中，在25 ℃下培养4～7 d。数日后观察菌落生长状况，最后将分离纯化的菌株保存于PDA斜面上，置4 ℃冰箱备用[8]。

1.2.4 采用二倍递减稀释法稀释苦参总生物碱和总黄酮

苦参总生物碱分别配制成40 mg·mL-1、20 mg·mL-1、10 mg·mL-1、5 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.312 5 mg·mL-1、0.156 3 mg·mL-1共9个不同浓度的供试药液。

苦参总黄酮溶液浓度分别为15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%共6个不同浓度的供试药液。

1.2.5 药敏琼脂培养基的制备

1.2.5.1含苦参总生物碱和总黄酮溶液的培养基制备

用移液枪分别吸取每个苦参总生物碱供试药液浓度1 mL，加入已灭菌的培养皿中，再趁热倒入已灭菌的PDA培养基20 mL，顺时针轻摇晃，保证供试液与培养基混合均匀，制成含供试药液的培养基[9]。每个浓度倒3皿，每皿约20 mL，9个浓度梯度，一个空白对照。并按照此方法对含苦参总黄酮溶液的培养基进行制备。

1.2.5.2苦参总黄酮对照组和农药处理组PDA培养基的制备

按照如上方法分别向灭菌的PDA培养基中加入95%的乙醇溶液和浓度为1 200 mg·mL-1的代森锰锌可湿性粉剂溶液各2 mL。

1.3 药敏试验

1.3.1 各个浓度的供试药液对黑斑病菌丝生长影响

人参黑斑病菌培养7 d后，选择均匀且长势好的菌落，用打孔器打出直径8 mm的菌饼数个，分别置于空白组、含苦参总生物碱、含苦参总黄酮溶液、含代森锰锌农药的供试药液培养基平板的中心，各个浓度的供试药液培养基和空白对照培养基每个3皿，每个培养基各放入一个菌饼。放培养箱中培养7 d，并设定温度为25 ℃，最后采用十字交叉法来测量菌落的直径，各个浓度测量3次，求平均值，用以下公式計算抑制率[10]。

1.3.2 各个浓度供试药液对黑斑病孢子萌发的影响

人参黑斑病原菌培养孢子7 d后，在超净工作台上选取生长良好、活力强病菌孢子，用无菌水配成10倍视野下100～120个病菌孢子的菌悬液。菌悬液对供试药液进行稀释，按计算好的400 μL中需加入不同浓度的供试药液量，用菌悬液稀释至400 μL并加入6孔凹板板孔中，放入恒温培养箱中培养1 d后，计算孢子萌发率和抑制率[11]。

1.3.3 数据分析

本次抑菌实验每个浓度重复3组，空白对照一组。实验结果采用SPSS 22.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 苦参总生物碱对人参黑斑病菌菌丝生长的影响

苦参总生物碱各不同浓度对人参黑斑病菌丝的生长均表现出抑制作用，人参黑斑病菌在浓度为10 mg·mL-1及以上的总生物碱供试药液培养基上，菌丝生长抑制率为98.8%。具体情况见表1。

2.2 苦参总生物碱对人参黑斑病菌孢子萌发的影响

苦参总生物碱不仅可以抑制人参黑斑病菌丝生长，而且还对黑斑病病菌孢子的萌发产生抑制作用。当总生物碱药液浓度为10 mg·mL-1及以上时，孢子萌发抑制率为100%，具体情况见表2。从表中可以看出，各个浓度总生物碱药液对孢子萌发均有较好抑制效果，证明总生物碱药液对人参黑斑病孢子的生长有抑制作用。

2.3 苦参总黄酮对人参黑斑病菌菌丝生长的影响

不同浓度苦参总黄酮溶液对人参黑斑病菌菌丝产生了不同程度的抑制作用，浓度越高，抑菌率越高，浓度在10%时，苦参总黄酮溶液的抑菌率为81.3%，高于农药组，且呈显著性差异，具体情况见表3。

3 结论

本试验属于人参叶片上黑斑病的室内离体试验，利用苦参提取物总生物碱对PDA培养基里的黑斑病菌落进行处理，观察其菌落和孢子是否停止生长或消失，从而检测苦参总生物碱是否对人参黑斑病有抑菌作用。试验结果表明，接菌后7 d，5 mg·mL苦参总生物碱药液处理的菌丝抑制率达94.4%;5 mg·mL苦参总生物碱药液浓度处理的孢子萌发抑制率为96.5%。在浓度为10 mg·mL及以上时与空白对照组相比，菌丝的抑制率为98.8%，孢子的抑制率为100%。苦参总黄酮对人参黑斑病菌菌丝生长的影响结果表明，浓度为10%及以上的苦参总黄酮溶液对人参黑斑病菌的抑菌效果最佳。本次试验数据表明，苦参总生物碱及总黄酮对人参黑斑病菌丝生长有抑制效果，苦参总生物碱对人参黑斑病孢子萌发也有一定抑制效果，这为研发新型植物源农药奠定了基础，可降低了农药大量使用对环境造成的污染。

参考文献：

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[2] 杨志欣，李霞，单柏松，等.苦参总黄酮的研究进展[J].中成药.2016，38：165-169.

[3] 侯丽.苦参生物碱提取工艺研究进展[J].农业科技与装备，2017（1）：60-61.

[4] 穆甲骏.苦参生物碱的分离纯化及其性能研究[D].郑州：河南工业大学，2015

[5] 崔鹦，张懿，胡春梅.苦参生物碱的提取与分离[J].重庆工学院学报（自然科学版），2007（3）：113-116.

[6] 黄琦.苦参黄酮类化合物的提取分离和生物活性研究[C].广东药科大学，2017.

[7] 项飞.胡柚皮膳食黄酮的提取[D].武汉：武汉工程大学，2016.

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[9] 孙磊，郭江玉，闫彦，等.苦参化学成分及其生物碱抑菌活性研究[J].辽宁中医药大学学报，2017，19（11）：49-53.

[10] 袁静，关丽杰，叢斌，等.苦参生物碱抑菌生物活性测定[J].农药，2005（2）：86-89.

[11] 李翔国，韩莲花，吴松权等.木醋液对人参黑斑病菌和人参灰霉病菌的抑菌作用[J].中药材，2014，37（9）：1525-1528.

（责任编辑：赵中正）