基于高分辨率熔解度曲线技术的金银花真伪鉴别方法研究

肖世昌 赵仲麟 张富丽 兰璞 陈泽一 王雨 徐石勇 赵清寰 宋君 刘征辉 王永 兰青阔

摘    要：金银花为常用大宗中药材，具有清热解毒功效，有些不法商家将价格便宜近十倍的山银花当金银花销售和使用，严重危害市场。为鉴别中药材金银花真伪，本研究基于高分辨率熔解曲线技术（High Resolution Melting，HRM），建立了金银花真伪分子鉴定方法。提取样品总DNA，对金银花及其伪品山银花的叶绿体基因组标志性核酸位点进行PCR扩增及HRM分析，并與标准样品的曲线作对比，判断供试金银花真伪。标志性核酸位点分型包括G/G、A/A两种，其中G/G型为金银花真品，A/A型为金银花伪品。本研究建立的基于HRM技术的金银花真伪鉴别方法具有快速、高通量的优点，为中草药监管和应用提供技术支撑。

关键词：金银花;真伪鉴别;高分辨率熔解度曲线技术

中图分类号：R282.5          文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.10.003

Study on Authenticity Method of Lonicera Japonica Based on High Resolution Melting Curve Technology

XIAO Shichang1，2，ZHAO Zhonglin2， ZHANG Fuli3，LAN Pu1，CHEN Zeyi2，WANG Yu2，XU Shiyong1，

ZHAO Qinghuan2， SONG Jun3， LIU Zhenghui1， WANG Yong1，LAN Qingkuo1

（1.Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China;2.College of Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002， China;3.Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China）

Abstract： Lonicera japonica is one of the most important herbal medicinal plants with applications in traditional Chinese medicine， which has antiseptic and antiviral curative effects.Some illegal venders replace Lonicera japonica with Lonicera Flos， which is nearly ten times cheaper.This mess has seriously disturbed the market. In order to identify the authenticity of Lonicera japonica Thunb.， a method based on the High Resolution Melting（HRM）technology was established in this study. Taking the flag nucleic acid site on chloroplast genome as target， total DNA extraction， PCR amplification and HRM analysis were performed by comparing with the curve of the standard sample，we can determine the authenticity of test samples. The genotyping of flag site includes G/G and A/A，of which the G/G stands for Lonicera japonica and the A/A stands for Lonicerae Flos.This study provided technical support for the identification of traditional Chinese medicine resources based on HRM technology to identify the Lonicera japonica， which had the advantages of rapid and high-throughput.

Key words： Lonicera japonica; authenticity identification; High-Resolution Melting Curve

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初开的花[1]，又名忍冬，是常用大宗中药材。金银花具有清热解毒功效，常用于治疗温病发热，热毒血痢，痈疡等症，亦可用于风热感冒，支气管炎等病症[1]。一些常用药如银翘解毒丸、连翘败毒丸[2]、双黄连口服液、清开灵注射液及口服液、银黄片、复方大青叶合剂等均以金银花为主要原料[3]，目前已经上市的80%的清热解毒杀菌类的中药处方中都含有金银花。

近年来，鉴于非典、禽流感、甲型流感、手足口病、新型冠状病毒等病毒性疾病的全球大爆发，清热解毒[4]药材金银花市场缺口比较大;随着我国对金银花开发利用取得突破性进展，不仅药用量连年增加，而且在茶叶、饮料、日化、化妆品和保健食品等领域的需求急剧增大。随着市场需求量不断增大及价格上涨，有些不法商家将价格便宜近十倍的灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand-Mazz.）、红腺忍冬（Lonicera Hypoglauca Miq.）、黄褐毛忍冬（Loniceraful

votomentosa Hsu et S.C.Cheng）等山银花[1]（Lonicerae

Flos）当做金银花销售和使用，对市场造成了严重危害，也严重损害了人民的健康和利益。因此，操作简单、步骤少、稳定性高的金银花真伪鉴别方法迫切需要得到应用与推广。基于PCR技术的现代分子生物学技术在中药鉴定中被广泛应用[5-6]，DNA 条形码标记技术多态性强、精准度高，是目前多态性最强和最精准的标记技术。蒋超等[7-8]建立了基于双向位点特异性PCR技术的金银花真伪及混杂品鉴别方法，但是在检测速度、通量和自动化分析方面还难以满足需求。

植物叶绿体基因组包含丰富的变异位点，可以作为超级条形码用于中药材鉴定，具有巨大的物种识别潜力[9]。本研究基于叶绿体基因组对贝母属植物进行分析，对SNP位点[10]在精准鉴定、精确定量应用方面进行了讨论，为川贝母中药资源鉴定提供了技术支撑[11]。董博然等[12]对龙胆科叶绿体基因组结构特征分析，显示出龙胆科植物独特的序列结构及其丰富多样的遗传信息，对物种资源保护及中藏药生药学研究等提供了科学依据。张中联等[13]通过分析传统药物龙血的完整叶绿体基因组显示，整个CP基因组可以用作识别这些龙血树属植物的超级条形码。本研究以金银花及其伪品灰毡毛忍冬为材料，基于高分辨率熔解度曲线技术（High Resolution Melting，HRM），對金银花叶绿体的标志性核酸位点进行分析，建立了快速、高通量、自动化的金银花掺伪鉴别方法，为规范、监管药材市场提供了技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

金银花及其伪品灰毡毛忍冬标准样品，由四川省农业科学院分析测试中心提供;市售金银花样品23#和90#由本实验室保存。

1.2 实验仪器

Neslab恒温水浴锅，Retsch MM400生物粉碎仪，Biorad CFX96 real-time PCR仪。

1.3 试验方法

1.3.1 总DNA提取 称取冷冻研磨后样品粉末200 mg，加入CTAB缓冲液（20 g·L-1 CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500 μL，65 ℃恒温水浴裂解30 min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。提取后的DNA统一稀释浓度至50±1 ng·μL-1。

1.3.2 PCR扩增及HRM 分析以提取的总DNA为模板，使用Bio-Rad CFX96实时定量荧光扩增仪进行PCR扩增和HRM分析试验。PCR反应体系总体积为20 μL，其中2×premix for probe（TaKaRa）10 μL，20×Eva green 1 μL，上游和下游引物10 μmol·L-1各1 μL，浓度50 ng·μL-1的基因组DNA模板2 μL，双蒸水5 μL;PCR扩增程序设置为95 ℃预变性10 min;40个扩增循环，其中95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec。HRM程序设置为95 ℃ 15 sec;55 ℃ 15 sec;55～95 ℃逐步升温，每上升0.2 ℃，15 sec。试验结束后，使用Precision Melt Analysis Software软件，比较HRM的标准视图（Normailized）和差异视图（Difference），对基因分型位点进行分型判定。

2 结果与分析

2.1 标志性核酸位点选择及引物设计

在NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）搜集忍冬属叶绿体核酸序列33条，包括忍冬金银花（Lonicera japonica）、灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides）、刚毛忍冬（Lonicera hispida）等。经过mafft序列比对，分析获得11 533个SNP位点，具有一致性的位点108个，上下游适合设计HRM引物的位点7个。选择其中第6号位点（MH028738.1，75 583bp）作为真伪鉴定标志性核酸位点CpnG-Sign（表1）。从表1可以看出，CpnG-Sign位点分型包括G/G、A/A两种，其中金银花忍冬（Lonicera japonica）真品为G/G型，灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides）、刚毛忍冬（Lonicera hispida）等山银花为A/A型。

使用软件LightScanner Primer Design software 设计PCR-HRM引物。引物序列如表2所示，引物由金唯智公司合成。

2.2 基于HRM的金银花真伪鉴别方法建立

以标准样品为对象，使用1.3试验方法进行DNA提取、PCR扩增及HRM分析。定义正品忍冬金银花的位点分型为G/G型，伪品山银花灰毡毛忍冬的位点分型为A/A型，优化、构建标准样品CpnG-Sign位点的HRM分析标准视图（图1A）和差异视图（图1B）。在两种视图下，正品忍冬金银花和伪品山银花灰毡毛忍冬的标志性核酸位点高分辨率熔解曲线明显分离，能够有效区分两种分型。

2.3 样品验证

用同样的方法对供试样品23#和90#进行DNA提取、PCR扩增及标志性核酸位点分型分析。经过HRM分析，与标准金银花样品的标准视图和差异视图的曲线进行比较分类，从而辨别供试金银花样品真伪。结果表明，样品23#的CpnG-Sign位点的HRM分析标准视图（图2A）和差异视图（图2B）与金银花真品的标准视图和差异视图一致，聚类判定为G/G分型，表明该样品为金银花真品。样品90#的CpnG-Sign位点的HRM分析标准视图（图2C）和差异视图（图2D）与灰毡毛忍冬的标准视图和差异视图一致，聚类判定该样品为A/A分型，表明该样品为金银花伪品。

3 结论与讨论

现代药理研究表明，金银花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解热、调节免疫等作用，曾在抗击流感中发挥了巨大作用。最近，新型冠状病毒的爆发，严重危害人民生命健康安全。有最新研究显示，金银花的抗病毒性对新型冠状病毒有一定的效果。新疆医科大学吉米丽汗·司马依等对金花清感颗粒辅助治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的活性成分研究探索表明金花清感颗粒的活性成分可能发挥对COVID-19的治疗作用[14]，金花清感颗粒的有效成分之一便是金银花。国医大师防治新型冠状病毒肺炎处方分析[15]，使用药物最多的是黄芪、藿香、金银花。

我国药用植物种类繁多、基源复杂，现在常用的检测技术，有传统的基于形态学标记鉴定和显微鉴定技术、基于药效成分的现代理化鉴定技术以及近年发展较快的分子标记鉴定技术。传统的经验鉴别对鉴定者要求较高，需要掌握足够的知识和经验，且鉴别结果取决于鉴别者的经验和知识;基于形态学标记的性状鉴定和显微鉴定难满足快速、精准的需要，鉴定结果可靠性较差而且费时费力;理化鉴定以中药有效成分为对象，能辨明中药材的真伪优劣，但对于掺杂现象鉴定效果不佳。相比于经验鉴别、显微鉴别和理化鉴别来说，分子鉴别技术准确度更高，且不受取样部位、环境因素等的影响，具有更高的稳定性和准确性。RFLP[16]、RAPD、AFLP等第一、二代标记技术位点开发难度大、重复性较差，不易大规模应用;SSR 技术开发成本低且多态性、重复性好，但单个SSR位点的多态性不足，需要筛选大量引物，且需要聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），工作量大[17]。这些鉴定方法在检测速度、通量、检测准确度等方面各有一定的限制。本研究在分子生物学的基础上，利用HRM法，从分子水平上检测金银花叶绿体[18]的特异核酸序列，对金银花与山银花叶绿体的标志性核酸位点进行分析。在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时40-90 min，HRM分析10-30 min，在1-2 h之内即可完成鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势，能高效准确的辨别金银花真伪。

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收稿日期：2020-05-26

基金項目：四川省创新能力提升工程公益深化项目（2016GYSH-032）;京津冀三地协同创新研发项目（18YFSDZC00020）

作者简介：肖世昌（1998—），男，河南郑州人，在读本科生，主要从事生物技术相关的研究。

通讯作者简介：兰青阔（1980—），男，河南南阳人，硕士，研究员，主要从事种质资源分子识别技术研究。