白羽肉鸡群中芙蓉沙门氏菌的分离鉴定

张开臣

摘  要：本研究旨在通过调查山东省某白羽肉鸡规模化养殖场的沙门氏菌感染和流行情况，为沙门氏菌病防控提供参考依据。采集该白羽肉鸡群未出壳死胚样品共60枚，进行沙门氏菌的分离与鉴定。结果显示：从60个鸡胚样品中供分离到23株沙门氏菌，分离率为38.33%，分离菌株均为芙蓉沙门氏菌。

关键词：沙门氏菌;芙蓉沙门氏菌;白羽肉鸡;分离鉴定

沙门氏菌（Salmonella）是一种无宿主特异性的革兰氏阴性菌，沙门氏菌感染家禽后会引起其发病死亡，给养殖场造成严重的经济损失[1]。目前，全世界范圍内已知的沙门氏菌血清型超过3 000种，分属不同的血清型，不同血清型沙门氏菌的鉴定具有流行病学意义[2]。沙门氏菌感染鸡群不仅严重影响种蛋的孵化率、雏鸡存活率和产蛋率，甚至造成人畜死亡[3]。因此，控制沙门氏菌在家禽和在食品中的污染对于兽医公共卫生和食品安全均具有重要的意义。

目前，我国常见的致病性沙门氏菌血清型主要包括鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌等多种血清型[2]，但目前国内外对芙蓉沙门氏菌流行状况的研究和调查资料很少。本研究应用白羽肉鸡群未出壳的死胚，完成了沙门氏菌的分离鉴定，评估了白羽肉鸡群中沙门氏菌的感染状态，补充了白羽肉鸡群沙门氏菌的流行病学资料，为今后芙蓉沙门氏菌的理论研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  试剂  缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸盐煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、半固体营养琼脂，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;酵母提取粉、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，均购自天际时开通化学试剂有限公司;琼脂粉，购自北京索莱宝科技有限公司;琼脂糖，购自南京生兴生物科技有限公司;TAE缓冲液，购自北京康为世纪科技有限公司;2×Taq Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DuRed核酸染料，购自北京泛博生物化学有限公司;沙门氏菌属诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司。

1.2  方法

1.2.1  样品的采集  收集未出壳的死胚60枚，在无菌环境下取出肝脏、卵黄和部分肠道。在分离组织样品操作过程中应注意避免样品交叉污染，可用无菌镊子夹取1 g左右新鲜鸡胚样品放于1.5 mL离心管内，研磨混合后做好记录并放于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2  沙门氏菌的分离鉴定  准确称取0.5 g（mL）研磨碎后的样品放入含有4.5 mL BPW的灭菌摇管中，反复吹打混匀，记录编号，放入恒温摇床中37 ℃、220 rpm/min培养大约8～12 h。轻摇混匀培养的菌液，转移0.5 mL的液体分别至含有4.5 mL的SC培养基与TTB培养基的灭菌摇管中，然后放置于恒温摇床中，37 ℃、220 rpm/min培养18～24 h。用无菌接种环分别蘸取TTB和SC的增菌液，利用三线法划线接种于XLD琼脂培养基， 置37 ℃温箱中培养24 h。

在XLD培养基上小心挑取3～5个疑似沙门氏菌的黑色圆润或无色透明、光滑单菌落，用500 μL LB液增菌4～6 h。根据张富友等[4]设计的引物进行PCR扩增，交由上海生工生物生物工程技术服务有限公司合成引物。扩增目的片段FimW基因的长度为495 bp，上下游引物分别为5'-AAC AGT CAC TTT GAG CAT GGG TT-3'和5'-GAG TGA CTT TGT CTG CTC TTC A-3'。反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃结束。PCR扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成像分析。

1.2.3  沙门氏菌血清学分型  利用沙门氏菌属诊断血清试剂盒进行沙门氏菌血清型的鉴定，具体操作如下：取保存备用的沙门氏菌菌液划线接种于XLD固体培养基上，放入恒温培养箱内，37 ℃培养24 h，蘸取可疑菌落继续接种于半固体琼脂平板上，放入恒温培养箱37 ℃条件下培养16～24 h;选择XLD固体培养基上的单个菌落进行O相血清凝集鉴定，首先在干净的玻片上滴加5 μL O多价A～F群血清，再点取XLD固体培养基上的单个菌落与血清混合均匀，1 min后肉眼观察并判断结果，然后依次用O单因子血清进行凝集试验，最终确定O抗原型。取无菌的生理盐水与诊断血清混匀，以此作为阴性对照;挑取半固体琼脂周边扩散的鞭毛进行H相血清诊断，鉴定方法同上，确定鞭毛抗原;将本试验的O相和H相结果与沙门氏菌的血清分型表进行比较分析，可以确定沙门氏菌的抗原类型以及其相应的血清型。沙门氏菌的血清型鉴定参考中华人民共和国国家标准GB/T 4789.4-2010：沙门氏菌检验标准。

2  结果

2.1  沙门氏菌的菌落形态与培养特性  将所有阳性样品进一步纯化接种XLD培养基，37 ℃培养24 h后平板上呈现出黑色中心、光滑，外周有一圈透明带的圆形菌落。

2.2  沙门氏菌的分离鉴定  用FimW引物进行PCR鉴定结果显示：从60个未出壳死胚样品中共分离到23株沙门氏菌，阳性检出率为38.33%，见图1。

2.3  沙门氏菌血清分型  血清分型试验结果表明：23株沙门氏菌均为芙蓉沙门氏菌。

3  讨论

本研究对该白羽肉鸡群死胚样品进行沙门氏菌的流行病学调查发现：60个未出壳死胚样品中共分离到23株沙门氏菌，阳性检出率为38.33%，高于范玉霞在2008年从青海省的养殖场死胚样品中的分离率21.43%（9/42）[5]和张丽芳等人从四川某种鸡场死胚样品的检出率15.38%（24/156）[6]，分离率高说明该鸡群沙门氏菌污染情况较为严重，引起鸡胚死亡的原因可能与沙门氏菌有关，但真正确定原因还需进一步的研究。

本研究分离得到的23株沙门氏菌，经血清分型鉴定后均为芙蓉沙门氏菌。目前国内只有吕素玲等在2012年报道禽肉中分离到1株芙蓉沙门氏菌[7]。本研究分离到的沙门氏菌分型鉴定结果，与宋艳2019年调查山东省部分养殖场沙门氏菌流行情況分离到的沙门氏菌血清型主要为鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌[8]的结果明显不同。美国2015年报道，70%的人感染沙门氏菌是由于禽类产品污染所致[9]，关于芙蓉沙门氏菌的致病性、毒力和耐药性鲜为人知，具体等待进一步的研究。

参考文献：

[1]  傅宏庆，刘莉，姚志兰，等.苏北地区白羽肉鸡父母代种鸡及其商品鸡中沙门氏菌的分离、鉴定与生物特性[J/OL].微生物学通报，2020.[2020-09-18].https：//doi.org/10.13344/j.microbiol.china.200631.

[2]  蒋勇军.肉鸡鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医文摘，2014，30（11）：46-47.

[3]  赵玉梅，范玉霞.肉鸡死胚中沙门氏菌的分离及血清学鉴定[J].山东畜牧兽医，2013，34（05）：1-3.

[4]  张富友，宋艳，徐煜琳，等.禽沙门氏菌鉴别培养基和PCR检测方法的建立[J].山东畜牧兽医，2019，40（10）：1-3.

[5]  范玉霞.肉鸡死胚中沙门氏菌的分离及血清学鉴定[J].四川畜牧兽医，2008（08）：27-28.

[6]  张丽芳，肖桥，罗薇.成都某种禽场鸡胚沙门氏菌的检测[J].中国畜牧兽医，2015，42（6）：1571-1579

[7]  吕素玲，韦程媛，姚雪婷，等.2010年广西食品中沙门氏菌污染状况和血清型分布及耐药谱的研究[J].应用预防医学，2012，18（03）：137-141+170

[8]  宋艳.山东省部分种鸡场死胚中沙门氏菌的鉴定及耐药特性研究[D].泰安：山东农业大学，2020.

[9]  ANDINO A，HANNING I.Salmonella enterica： survival，colonization，and virulence differences among serovars[J].The scientific world journal，2015：1-16.

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