血清4型禽腺病毒山东株基因组序列的克隆及遗传演化分析

宋玲玲

摘  要：从山东某地区发生心包积液综合征的发病鸡中收集病料，按常规方法处理后接种SPF鸡胚，分离到1株病毒，经PCR和测序分析鉴定该分离株为I群禽腺病毒、血清4型禽腺病毒，命名为FAV-SD。合成引物成功扩增病毒全基因组序列，并进行序列的测定与分析，结果表明FAV-SD株全基因组大小为43752 bp，通过hexon基因同源性比对，FAV-SD与我国今年报道的禽腺病毒血清4型同源性最高;遗传进化分析结果表明，FAV-SD分离株与我国禽腺病毒血清4型流行毒株处于同一分支，而与国外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支，存在遗传差异，说明中国流行的血清4型禽腺病毒具有自身地域特点。该病毒株的分离鉴定为禽腺病毒疫苗的研制奠定了基础。

关键词：I群禽腺病毒;血清4型;分离鉴定;同源性

禽腺病毒（Fowl adenovirus， FAdV）根据群特异性抗原的不同分为3个群，I群禽腺病毒具有共同的群抗原[1]。该群病毒在鸡、鸭、鹅体内普遍存在，能使禽群呈隐性感染，作为继发病原共同作用于家禽，并能垂直传播，污染鸡胚[2]。FAdV血清型众多，根据血清中和试验可将FAdV分为12个血清型，分别为血清型1～8a、8b～11[3]。I群禽腺病毒的12个血清型均能感染鸡，引发不同程度的肝炎症状。FAdV血清1型的鸡胚致死孤儿病毒（Chicken embryo lethal orphan virus，CELO）可导致肌胃糜烂（Gizzard erosions，GE）;血清4型FAdV感染可引起心包积水综合征（Hybropericardium syndrome，HPS），剖检以淡黄色心包积液或者心包内冻状物为特征，同时伴有肝脏坏死，因此也常称为肝炎-心包积水综合征（Hepatitis-Hydropericardium syndrome，HHS），死亡率高达30%～90%[4-6]。1987年在巴基斯坦安卡拉地区的肉鸡场爆发了一种以心包积液为特征的疾病，称为心包积液综合征，又称安卡拉病，该病后来蔓延至全国，给当地的肉鸡养殖业造成了极大的损失。随后心包积液综合征在科威特、伊朗、日本、墨西哥等地相继发生。经研究证实，这些地区的心包积液综合征均由I群禽腺病毒的血清4型引起。

自2013年以来，我国鸡群陆续爆发以肝脏坏死为特征的鸡包涵体肝炎，死亡率约10%～30%。2014年突然出现典型的以心包中有淡黄色液体或凝胶样物为特征的心包积水综合征，该病在我国鸡群中大面积爆发，病雞出现突然死亡，死亡率达30%～90%。2015年6月，山东省部分地区的817肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病，随后该病传至山东省多个地区，感染宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种[7-9]。2015年夏，禽心包积水-包涵体肝炎综合征（Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）在山东、河南、辽宁、广东等地呈现大规模爆发，给我国家禽业带来了重大的经济损失。

根据病毒基因组特征，可将FAdV分为5个种，即A～E种。FAdV 12个血清型属于不同种，其中A种包括血清1型，B种包括血清5型，C种包括血清4型和血清10型，D种包括血清2、3、9和11型，E种包括血清6、7、8a和8b。对我国2014～2016年部分地区鸡群病料进行检测和流行病学研究发现，我国目前FAdV主要流行毒株为C、D、E三个种，其中C种FAdV以血清4型为主[10]。

FAdV属于禽腺病毒I群，结构为非折叠的二十面体，病毒粒子大小在70～90 nm。该病毒粒子具有252个衣壳粒，其中240个非顶角壳粒为六邻体（hexon），12个顶角壳粒为五邻体（Penton），每个五邻体有2条纤维突起（Fiber）。研究表明，hexon蛋白带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇，可以引发极强的中和反应，具有被中和抗体识别表位，因此hexon基因通常用于FAdV种的分类[11-13]。FAdV基因组为双股线性DNA，基因组大小约为43～45 kb，不同种FAdV基因组结构不完全相同，但同一种内不同血清型病毒的基因组结构相似。某些基因在各血清型FAdV中较为保守，如hexon基因的部分片段，因此该基因可作为诊断型和群的首选蛋白。本研究对分离获得的FAdV毒株进行全基因组克隆，对该病毒株进行鉴定及遗传变异分析，探讨我国流行毒株与已报道的禽腺病毒的亲缘关系，了解该病的感染流行特点，为禽腺病毒感染的防控提供理论依据，以促进家禽养殖业健康发展。

1  材料和方法

1.1  病毒、载体及鸡胚  FAdV-4 SD2016毒株由山东省农业科学院家禽研究所分离、鉴定、纯化并保存，pEASY-T3 Cloning Vector、DH5a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，SPF鸡胚由山东昊泰实验动物繁育公司提供。

1.2  工具酶和主要试剂  LA Taq with GC buffer、dNTP Mixture、DL2000DNA Marker、病毒基因组DNA提取试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司;T3载体为北京全式金生物技术有限公司产品;质粒提取及胶回收试剂盒购自BIOMIGA公司;其他化学试剂为国产分析纯。

1.3  引物合成  参考GenBank公布的I群禽腺病毒全基因组序列，设计用于扩增病毒全基因组的引物序列，见表1;引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。离心后加入DEPC水溶液至工作浓度10 μmol/L，-20 ℃保存备用。

1.4  病毒基因组DNA的提取与PCR扩增  取SPF鸡胚扩增的FAdV-4 SD2016病毒绒毛尿囊膜上清液，将准备的病毒液反复冻融三次，8000 r/min离心10 min后取上清，将200 μL上清液作为病毒DNA提取样品，按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书进行操作。

以病毒DNA为模板，分别用相应的引物对其进行PCR扩增。反应体系如下：DNA模板3 μL，用灭菌去离子水补至总体积50 μL，于控热循环仪上进行扩增。PCR循环反应条件为：94 ℃预变性3 min，然后进入94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共进行35个循环;72 ℃延伸10 min，最后停止于4 ℃。将PCR扩增结果经1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5  PCR产物的克隆与鉴定  用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增的核苷酸片段，回收产物与pEasy-T3克隆载体连接，并转化Trans1-T1感受态细胞。挑取白色菌落接种于抗氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃， 220 r/min振荡培养。使用引物M13F、M13R对液体LB培养菌液进行PCR鉴定。

1.6  序列测定与分析  将鉴定为阳性的菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析。测序结果用DNAStar软件包进行核苷酸序列的拼接、开放阅读框（ORF）的确定以及氨基酸推到序列的预测，并分析全基因组特点。

1.7  序列比对及遗传进化分析  PCR扩增得到的hexon基因序列经BLAST在线比对和Lasergene软件分析（DNAStar），与国内外FAdV毒株的同源基因序列进行同源性比对，利用分子生物学软件MEGA6.0对分离毒株和参考毒株进行遗传演化分析，用最大似然法（Maximum Likelihood， ML）绘制系统进化树。

2  结果

2.1  序列的测定、处理与基因组分析  用引物成功地扩增出FAdV-4 SD2016毒株的基因全序列，并进行了鉴定和测序。用DNAStar软件包将测序所得结果进行拼接，对部分ORF的位置以及编码的蛋白进行了预测，见表2。

2.2  分离株Hexon蛋白基因序列测定及同源性分析  对分离株FAdV-4 SD2016的hexon基因序列与已报道的FAdV毒株同源基因进行同源性比对，FAdV-4 SD2016与FAdV血清4型同源性最高，结果如图1所示。其中FAdV-4 SD2016分离株与近几年中国血清4型FAdV分离株JSJ13、HN/151029、HLJFAd15、HLJDAd2015、CH/AHBZ/2015、CH/JSXZ/2015、HLJ/151118的同源性为100%，与墨西哥毒株MX-SHP95的同源性为98.6%。分離株FAdV-4 SD2016与A、B、D和E种FAdV的同源性分别为76.1%、73.4%、69.5%～71.5%和74.3%～75.2%。hexon基因序列比对的结果表明，分离株与A、B、D和E种FAdV核酸序列差异较大。

2.3  分离株hexon蛋白基因遗传进化分析  对分离株FAdV-4 SD2016的hexon基因序列与已报道的FAdV毒株同源基因进行遗传进化分析，用ML方法构建系统发育进化树。根据hexon基因的系统进化树，FAdV分为5个种，分别为FAdV A～E种（见图2）;分离株划分为禽腺病毒C种、血清4型。在C种内，分离株与中国分离株HLJFAd15、HLJ/151118、CH/AHBZ/2015、HN/151029、HN/151025、JSJ13、CH/JSX2/2015、HLJDAd2015亲缘关系最近，处于同一个分支，与奥地利毒株KR5、加拿大毒株ON1和墨西哥毒株MX-SHP95的遗传进化有一定差异，而且分离株与FAdV A、B、D、E种毒株亲缘关系较远。

3  讨论

禽心包积水-包涵体肝炎综合征（HPS-IBH）主要是由FAdV-4引起的一种高死亡率的传染病，研究表明该病爆发造成了巴基斯坦多个养殖场鸡只死亡率高达75%，而在印度该病的死亡率高达80%[14]。自1987年在巴基斯坦报道心包积水综合征后，美国、西班牙、韩国、日本、波兰等国先后报道了该病的流行[15-19]。2012年起，禽心包积水-包涵体肝炎综合征（HPS-IBH）在我国多地零星爆发;2015年，我国部分地区出现高死亡率的鸡心包积水综合征，死亡率约30%～90%，给我国养鸡业带来重大的经济损失。对2014～2016年的禽腺病毒感染的流行病学调查结果表明，我国大部分地区的鸡群均存在禽腺病毒感染[20]。

临床病料检测发现，多数心包积液的病例不仅仅存在禽腺病毒感染，而是同时存在传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus， IBDV）或鸡传染性贫血病毒（Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV）感染，甚至3种病毒的混合感染。研究发现传染性法氏囊病病毒、传染性贫血病毒可导致I群禽腺病毒的继发感染，同时传染性法氏囊病病毒本身就有很强的致死性，这些都是造成禽腺病毒高发病率、高死亡率的原因[17，21]。因此，加强原发病原的免疫防控对预防禽腺病毒感染意义重大。

近年来，陆续有报道指出适应细胞的FAdV-4活病毒疫苗、油乳剂灭活疫苗、鸡胚弱化的活毒疫苗均可对该病产生很好的免疫保护作用[22]。利用该分离株进行了灭活疫苗免疫实验，结果表明，灭活疫苗具有良好的免疫保护作用，可为禽腺病毒的疫苗防控提供候选疫苗株。

本研究对分离获得的血清4型禽腺病毒FAdV-4 SD2016毒株的全基因组进行了克隆，序列分析表明，其与国内近期公布的血清4型禽腺病毒亲缘关系很近，可用于该病的防控措施研究。禽腺病毒hexon蛋白含有主要的特异性抗原决定簇，可被中和抗体识别，是FAdV的主要免疫保护性蛋白。本研究对分离株的hexon基因进行同源性分析和遗传进化分析，二者分析结果较为一致，分离株FAdV-4 SD2016与C种、血清4型病毒株同源性最高，在系统发育进化树中与血清4型处于同一分支。该分离株与国内目前报道的多个病毒株同源性较高，与国外病毒株存在一定差异，说明国内的血清4型禽腺病毒在遗传进化上有地域特点。分析发现，该分离株Hexon基因的氨基酸发生了变异，其变化位点可能属于主要抗原表位区域。研究发现抗原表位可作为新型多肽疫苗的有效成分，因此该分离株对开发新型疫苗具有重要意义。

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