新型鸭呼肠孤病毒分离鉴定及σC基因进化分析

申翰钦

摘  要：新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck orthoreovirus，NDRV）在番鸭和北京鸭上流行，引起番鸭的肝斑状出血和北京鸭的脾坏死。本研究从广东云浮某养殖场发生以肝脏出血为病变的番鸭中分离到一株NDRV，命名为GD-YF-202001。对GD-YF-202001株的σC基因进行RT-PCR扩增、克隆测序与序列分析。结果显示，分离株σC基因与NDRV SDJN18毒株同源性最高，遗传距离较近;分离株σC氨基酸序出现多个氨基酸位点突变，发生了较大的变异。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒;NDRV;分离鉴定;σC基因;进化分析

新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck orthoreovirus，NDRV）属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属成员，基因组由10个双链RNA片段组成。NDRV感染番鸭主要引起肝脏斑状出血和坏死，感染北京鸭主要引起脾坏死等症状[1，2]。NDRV感染能引起免疫器官，因此被认为是鸭群重要的免疫抑制病，发病日龄在5～25 d左右，死亡率为5%～50%，且发病日龄越小，死亡率越高[2，3]。近年来，该病在山东、河南、河北、安徽、辽宁、福建、广东等地均有发生，严重影响养鸭业的发展[4，5]。

本研究于2020年从广东云浮某养殖场出现典型肝脏斑状出血症状的番鸭病料中分离到一株NDRV，并对σC基因测序及遗传进化分析，以探究分离株的生物学特性，以期为NDRV流行病学调查积累数据，为该病防控提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  临床样品采集与病毒分离  发病番鸭群死淘率约20%，病死鸭剖检可见肝斑状出血。采集发病鸭只的肝脏和脾脏组织，剪碎，加入5倍量PBS以及2000 IU/mL的青霉素、链霉素研磨成糜状，移入灭菌离心管中，在4 ℃的冰箱中放置3 h后，反复冻融3次，8000 rpm离心5 min，取上清接种Vero细胞和DEF细胞，37 ℃培养3～5 d，待超过50%细胞出现CPE后冻存于-80 ℃备用。

1.2  RT-PCR检测  取1.1中收集的细胞上清，按照HiPure Viral RNA/DNA Kit试剂盒说明书提取病毒RNA。使用TaKaRa公司PrimeScriptTM One-Step RT-PCR试剂盒进行σC基因扩增（上游引物：5′- GCATGCAATGGTGGTACAGTG -3′;下游引物：5′- CTTACTGCGTGACATGGACC -3′）[4]，反应条件为：50 ℃ 30 min;94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共进行35个循环;72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖电泳检测扩增产物，回收目的片段，克隆至pMD19-T载体，转化至Dh5α感受态细胞，阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3  σC基因测序与分析  用DNAStar软件对分离株与参考毒株σC基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析。使用MEGA-7软件邻位相接法构建进化树。

2  结果

2.1  病毒分离鉴定  临床病料分别接种Vero和DEF细胞，培养3～5 d，细胞出现融合、裂解等典型的CPE，见图1。细胞上清液RT-PCR检测结果显示NDRV阳性。分离毒株命名为GD-YF-202001株。

2.2  σC基因测序与分析  测序获得σC基因长966 bp的开放性阅读框，编码321个氨基酸残基。对获得的序列进行同源性分析，结果显示分离株与NDRV SDJN18株同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分别为96.3%和96.0%;与NDRV代表毒株TH11和091核苷酸同源性分别为94.1%和95.0%，氨基酸同源性分别为95.3%和95.0%，见表1。

2.3  氨基酸序列变异分析  GD-YF-202001株σC氨基酸序列发生多个位点的突变，主要在第200（G→D）、207（I→T）、223（M→L）、255（M→L）、289 （S→T）、298（A→V）、300（V→I）、304（S→P）、310（Q→R）位氨基酸，见图2。这些氨基位点的突变与独立的相关性需要进一步的研究。

2.3  遗传进化分析  遗传进化分析结果表明，GD-YF-202001株与NDRV SDJN18株和SDHZYC株遗传距离较近，但与SDJN18所在的Clade II分支仍有一定的遗传距离，形成独立的分支。NDRV代表毒株TH11和091屬于Clade I分支，由进化树可见，GD-YF-202001株介于Clade I与Clade II之间，见图3。

3  讨论

NDRV在国内分布广泛，番鸭、半番和白鸭均易感，能引起较高的死亡率，严重威胁我国水禽产业的发展[4]。目前尚未有商品化的疫苗用于该病的预防，做好生物安全措施是防控该病的重要手段，特别是做好孵化场消毒工作，避免鸭群从孵化场感染带毒。NDRV感染可导致免疫抑制，容易引起细菌性疾病的继发，且继发感染后抗生素治疗效果较差，造成严重的经济损失。

本研究从广东云浮某养殖场发生肝脏斑状出血症状的番鸭群中分离到1株NDRV，该毒株感染Vero和DEF细胞引起典型的CPE[6]，在DEF细胞上毒价可达108 TCID50/mL，提示鸭呼肠孤病毒具有广泛的细胞嗜性。σC基因进化分析发现该毒株处于Clade I和Clade II之间，氨基酸序列发生多个位点突变。这些突变位点位于病毒表面，集中在200～310位氨基酸之间，突变是否与毒力相关还需要进一步研究。

参考文献：

[1]  张思远，卢秀娴，云骜，等. 新型鸭呼肠孤病毒广东分离株σC蛋白基因序列分析[J]. 中国兽药杂志， 2019， 53（12）： 1-6.

[2]  黄瑜，苏敬良，施少华，等. 我国鸭呼肠孤病毒感染相关的疫病[J].中国兽医杂志，2009，45（07）：57-58.

[3]  Wang H， Gao B， Liu X， et al. Pathogenicity of a variant duck orthoreovirus strain in Cherry Valley Ducklings[J]. Veterinary Microbiology， 2020， 242： 108546.

[4]  Cao Y， Sun M， Wang J， et al.Phenotypic and genetic characterisation of an emerging reovirus from Pekin ducks in China[J].Scientific Reports， 2019， 9（1）：478-484.

[5]  Wang H， Gao B， Chen H，et al.Isolation and characterization of a variant duck orthoreovirus causing spleen necrosis in Peking ducks， China[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2019，66（5）：2033-2044.

[6]  罗丹，高立，孟照洁，等. 新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及其σC基因遗传进化分析[J].中国预防兽医学报，2020，42（05）：445-450.