熊果酸抑制肿瘤生长机制研究进展*

朱兆伟，相芬芬，范 嫣，康向东，吴 蓉

上海中医药大学附属普陀医院检验科(上海 200333)

根据GLOBOCAN 2018统计收集来自185个国家18亿人住院登记数据，2018年诊断为癌症的患者是1800万人，有960万人死因为癌症[1]。中医药在抗肿瘤的治疗中得到广泛应用并取得良好疗效。熊果酸(Ursolic acid，UA) 又名乌索酸(乌苏酸)，属五环三萜类化合物，广泛存在自然界植物中，如山楂、熊果、乌梅、陆英、芦笋、野蔷薇果、车前草、女贞子。近年来，随着对熊果酸抗肿瘤特性研究的深入，研究者发现熊果酸具有抗肿瘤谱广、对正常细胞毒性低的特点，其可从多个途径抑制肿瘤的发生、发展，因此其抗肿瘤作用日益受到关注[2-4]。现将近几年熊果酸抑制肿瘤作用机制的研究进展综述如下。

1 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是受基因调控的一种细胞自主、程序性死亡方式，与肿瘤的发生、发展密切相关，并涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。因此，靶向诱导肿瘤细胞凋亡，是抑制肿瘤重要方式。

1.1 半胱天冬酶(Caspase)途径 Chen等[5]发现熊果酸抑制口腔癌细胞活力，诱导细胞死亡是通过介导半胱天冬酶途径，增加了口腔癌细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性，降低了AKT(Ser473)的磷酸化Bcl-2相关的细胞死亡激动剂(BAD;Ser136)，以及Bcl-2 和Bcl-xL的蛋白质水平，并增加BAD和Bax蛋白在口腔癌细胞中的表达。熊果酸增强口腔癌化疗效果具有潜在价值。

1.2 Rho激酶(ROCK)/磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)途径 Mu等[6]发现ROCK1/PTEN - 丝切蛋白(Cofilin-1)/细胞色素(Cytochrome) c蛋白表达介导了Caspase-3/9活性，部分通过ROCK/ PTEN直接靶向介导Cofilin-1线粒体易位，进而诱导人前列腺癌细胞凋亡。Meng等[7]发现熊果酸显著抑制前列腺癌DU145细胞生长并诱导细胞凋亡，以及增加DU145细胞的Caspase-3和Caspase-9活性。此外，熊果酸能显着激活并抑制细胞质和线粒体细胞色素c蛋白表达。熊果酸的抗癌作用通过ROCK/PTEN介导的前列腺癌细胞中cofilin-1的线粒体转位激活细胞凋亡。

1.3 PI3K/Akt途径 Gai等[8]发现UA不仅抑制细胞生长，还通过调节人前列腺癌中PI3K/Akt/mTOR通路诱导细胞凋亡。UA诱导细胞凋亡与Bcl-2、Bcl-xl、Survivin、活化Caspase-3的表达减少，且与抑制PI3K、Akt和mTOR信号蛋白磷酸化的表达有关。Chuang等[9]发现UA与抗凋亡蛋白髓样细胞白血病1(Mcl-1)、Bcl-xL、Bcl-2和翻译调控肿瘤蛋白(TCTP)的表达减少，及其凋亡相关蛋白肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、脂肪酸合成酶(Fas)、 Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、B细胞白血病淋巴瘤相关蛋白基因(Bax)、Caspase-3、8、9和聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)表达增加有关。UA通过调节PI3K/Akt诱导细胞凋亡，以及激活p38/JNK 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。Villar等[10]发现UA阻滞AKT/GSK3β/β-连环蛋白的存活信号通路，导致抗细胞凋亡蛋白荷瘤小鼠核蛋白类调控基因(c-Myc)和 p21下调，共同导致细胞内凋亡的激活。UA能够诱导人软组织肉瘤(STS)细胞凋亡，通过阻断AKT信号通路使STS细胞对多柔比星敏感。因此，它作为营养保健佐剂与多柔比星一起使用可以不增加化疗药物剂量和毒性，改善软组织肉瘤患者的治疗结果。

1.4 线粒体途径 Lewinska等[11]研究发现，UA诱导AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)的能量应激激活，导致细胞毒性自噬和细胞凋亡。UA介导的一氧化氮水平升高和共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)激活也可以解释AMPK激活-介导的细胞毒性反应。此外，UA增强细胞凋亡与磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)信号降低有关和线粒体膜电位的去极化。UA诱导的糖酵解途径的变化可能导致细胞毒性自噬和细胞凋亡死亡，是一种有吸引力的抗癌策略。Jin等[12]发现，UA和叶酸组成(FA-CS-UA-NPs)通过叶酸受体介导的内吞途径容易地被癌细胞内化。FA-CS-UA-NPs进入溶酶体，破坏了溶酶体膜的通透性，然后从溶酶体中释放出来。FA-CS - UA-NPs在线粒体中的延长保留诱导了ROS的过量产生和线粒体膜电位的破坏，并导致乳腺癌细胞不可逆的细胞凋亡。Wang等[13]发现，熊果酸降低了细胞凋亡调节因子(BCL2/BAX)的比例，导致线粒体电位紊乱并诱导细胞凋亡，抑制人宫颈癌细胞模型裸鼠肿瘤生长。Chen等[14]发现熊果酸降低肺癌NCI-H292细胞活力并诱导细胞凋亡。熊果酸增加NCI-H292细胞Ca2+产生，但不影响ROS的产生。UA诱导细胞凋亡通过NCI-H292细胞线粒体释放凋亡诱导因子(AIF)和内切酶G。

1.5 转录激活因子(STAT3)途径 Kim等[15]发现熊果酸通过上调miR-4500和抑制信号传导与STAT3磷酸化诱导直肠癌细胞凋亡。Liu等[16]发现，UA可以抑制由白细胞介素(IL)-6 信号传导与诱导磷酸化转录激活因子3(P-STAT3)在Hep3B肝癌细胞中表达。UA也抑制人肝癌细胞系HEPG2，772和Huh7中组成型STAT3磷酸化。UA还抑制细胞活力、细胞迁移和肝癌细胞集落形成。UA广泛存在于水果和草药，可以通过抑制STAT3的活化来抑制人肝癌细胞体外和体内的生长。熊果酸可能是一种潜在的预防保健产品，以及有希望成为肝癌化疗辅助药物。

1.6 其他途径诱导肿瘤细胞凋亡 Lin等[17]发现UA在K562和K562/G01中与伊马替尼联合使用时具有协同作用。证据表明UA在K562细胞中的促细胞凋亡作用与独立生长因子1(Gfi-1)/Stat5/Akt有关途径。UA可能是治疗慢性粒细胞白血病有用的药物。Sohn等[18]发现熊果酸通过抑制上皮细胞-间充质转化(EMT)和激活let7b诱导间皮瘤细胞凋亡，作为治疗恶性间皮瘤的有效药物。

2 抑制肿瘤细胞增殖

肿瘤的生长与肿瘤细胞的不受机体调控而异常增殖所致，因此抑制肿瘤细胞的增殖是抑制肿瘤生长的重要方式，有效抑制肿瘤细胞增殖也是评价抗肿瘤药物疗效的基本要求。有许多研究明确表明熊果酸对多种肿瘤具有抑制增殖作用。Shan等[19]用熊果酸可抑制CRC细胞增殖和诱导细胞凋亡，并增强奥沙利铂对细胞的毒性作用，这种效果是随着B淋巴细胞瘤(Bcl)-xL、Bcl-2、生存素(Survivin)的下调，激活半胱天冬酶(Caspase)-3,8,9，抑制鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)、抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)1/2、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、p-38、C-Jun 氨基末端激酶(JNK)、蛋白激酶B(AKT)、核因子κB激酶抑制剂(IKKα)、NF-κB抑制蛋白α(IKBα)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)和核因子-kappa B(NF-κB)信号通路p65磷酸化表达。此外，熊果酸能还原用奥沙利铂处理过小鼠的肝功能和增加体重。因此，熊果酸可以增强奥沙利铂对CRC的体外和体内治疗作用，减轻奥沙利铂引起的不良反应。

3 阻遏细胞周期

熊果酸通过调节基因作用对细胞增殖有影响。Xiang等[20]发现UA可抑制人胃癌细胞的体外生长和转移。用UA处理BGC-823细胞后，使细胞凋亡和G1期增加，细胞迁移受到抑制，Bax、Caspase-3、Bcl-2表达降低。UA上调了BGC-823细胞微小RNA-133a(miR-133a)水平。miR-133a过表达增加了BGC-823细胞G1期的细胞周期和降低了Akt1的表达。UA对治疗继发miR-133a表达增加胃癌患者有效。Zhang等[21]在目前的研究中，我们证明了p21在熊果酸的G1细胞周期停滞中发挥了中介作用，而p21介导的Mcl-1上调可以降低熊果酸的凋亡作用。这些结果表明p21活性，在细胞周期和细胞凋亡调节方面起双重作用。 熊果酸诱导p21的产生是由于p53转录激活。熊果酸能够抑制小鼠双微体基因(MDM2)和T-LAK细胞源蛋白激酶(TOPK)，是p53的两个负调节因子，反向促进熊果酸诱导p53激活。

4 肿瘤药物增敏及逆转耐药性

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药常常最终导致化疗失败，熊果酸具有逆转肿瘤药物耐药性和药物增敏作用。Manouchehri等[22]发现UA是一个有效的凋亡诱导配体(rhTRAIL)增敏剂诱导三阴性乳腺癌rhTRAIL耐药的细胞凋亡。Zhang等[23]用熊果酸和奥沙利铂治疗CRC细胞监测对细胞增殖、凋亡、活性氧(ROS)和耐药基因产生的影响。发现了熊果酸和奥沙利铂组合治疗方法显著抑制细胞的增殖，增加细胞凋亡和ROS产生，并显著抑制耐药基因P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP) 、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)蛋白和mRNA 表达水平，达到增强奥沙利铂治疗结直肠癌的疗效。Wang等[24]证明在缺氧条件下UA可以抑制卵巢癌CSCs细胞的增殖和逆转耐药性通过下调HIF-1α和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2抗体(ABCG2)的表达。UA诱导的HIF-1α下调和ABCG2减少，PI3K/Akt信号通路激活在其中起重要作用。研究表明UA是一种传统的化合物中药，是一种有希望的逆转卵巢癌CSCs细胞耐药性的药物。Shan等[25]证明UA是能够通过抑制多药耐药基因(MDR)1的表达，下调缺氧诱导的低氧诱导因子(HIF)-1α积累，解释了UA在缺氧条件下逆转结肠癌细胞的化疗耐药性的作用。

5 诱导肿瘤细胞自噬

自噬对肿瘤细胞所起的作用是两面性。正常生理情况下，细胞自噬利于细胞保持自稳状态，在发生应激时，细胞自噬防止有毒或致癌的损伤细胞质和细胞器的累积，抑制细胞癌变；然而肿瘤一旦形成，细胞自噬为癌细胞提供更丰富的营养，促进肿瘤生长。Luo等[26]发现熊果酸能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。熊果酸可通过PI3K/AKT信号传导途径的失活来抑制乳腺癌细胞的增殖。熊果酸通过糖原合成酶激酶(GSK)和Bcl-2/Caspase-3信号传导途径诱导自噬和凋亡，并且熊果酸下调乳腺癌细胞中的NF-κB来抑制炎症反应的作用也参与抑制细胞增殖。Jung等[27]研究了UA诱导嗜铬细胞瘤(PC-12)细胞死亡。通过降低Bcl2、激活Caspase-3和诱导聚(ADP-核糖基)聚合酶的裂解来诱导细胞凋亡。探讨UA影响自噬进展，p62水平及微管相关蛋白轻链3 (LC3)-Ⅰ至LC3-Ⅱ转化率是自噬通量重要检测标志物。UA诱导p62的增加，增大了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率。结果表明UA引起自噬，但下游信号通路受阻。总之，这项研究表明UA通过诱导细胞凋亡和损害自噬过程来杀死PC-12细胞。

6 通过调控癌基因和抑癌基因抑制肿瘤细胞生长

肿瘤细胞发生、发展、耐药过程中，受癌基因与抑癌基因的调控。因此，通过调控癌基因和抑癌基因抑制肿瘤生长。Yang等[28]结果显示UA抑制HCC细胞的生长，是通过介导p38MAPK诱导抑制胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)1和叉头框转录因子O3a(FOXO3a)的表达的。Yie等[29]发现UA抑制了HCC细胞的生长，以剂量和时间依赖的方式诱导细胞凋亡。发现UA诱导AMP激活的蛋白激酶α(AMPKa)磷酸化和呈剂量依赖性抑制DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达。此外，UA抑制转录因子Sp1的表达。相反，Sp1的过表达逆转了UA对DNMT1表达和影响细胞的生长。结果首次表明了UA通过AMPKa介导抑制作用Sp1蛋白来抑制HCC的生长，这反过来导致DNMT1的抑制。该研究揭示了UA抑制HCC细胞的生长的新机制，并揭示DNMT1可能是HCC化疗新靶点。Wang等[30]结果表明下调组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7可以降低核因子E2相关因子2(Nrf2)和Nrf2-靶基因的表达，以及苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)和UA诱导Setd7表达，激活Nrf2/抗氧化反应元素(ARE)信号通路并保护DNA免受氧化损伤来抑制人前列腺癌细胞生长。

7 细胞毒性作用

熊果酸对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，通过结合补体抗体介导。Junco等[31]发现熊果酸对皮肤癌细胞毒性作用有显著影响，是通过AMPK和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)途径起作用。Shen等[32]发现，UA组成的两亲性自组装纳米药物，由乳酸菌酸(LA)和低聚氨基胺(low-PAMAM)树突状大分子构成。结果表明，该近球形纳米药物对肝癌SMMC7721细胞有增强细胞毒性作用，并有可能在无毒浓度下通过抑制转移相关蛋白MMP-9的表达，降低SMMC7721细胞的迁移和粘附。此外，体内研究表明，纳米药物具有延长血液循环时间的作用同时增加AUC、MRT、Cmax，能有效抑制H22小鼠模型肿瘤生长。总之，UA的纳米药物传递系统，为靶向肿瘤治疗提供一种新的策略。

8 抑制血管生成

血管生成是肿瘤生长、侵袭和转移过程的关键，为肿瘤的生长提供营养支持。抑制肿瘤血管生成是一种全新的靶向治疗策略，可以最大限度地控制和杀灭肿瘤。Wu等[33]发现熊果酸及其衍生物下调HIF-1α蛋白表达，通过抑制其合成，降低血管内皮生长因子的产生，抑制结肠癌细胞的增殖。

9 抑制肿瘤的转移和侵袭

恶性肿瘤最显著的生物学特征是转移和侵袭，也是临床病人死亡的主要原因。熊果酸具有抑制恶性肿瘤转移和侵袭的作用。Ruan等[34]研究发现熊果酸显著减弱了转化生长因子-β1(TGF- β1)诱导的E-钙粘蛋白水平的降低和N-钙粘蛋白水平的升高。此外，熊果酸抑制H1975细胞中的间充质样反应，包括细胞迁移、侵袭和基质金属肽酶(MMP)-2和-9的活性。熊果酸可通过TGF-β1信号通路介导的整合素αVβ5表达抑制非小细胞肺癌(NSCLC)中的上皮细胞-间充质转化(EMT)，这可能是熊果酸抑制NSCLC侵袭和转移的潜在机制。熊果酸减弱了H1975细胞中TGF-β1诱导的EMT，可能是有希望治疗NSCLC的药物。

10 结 语

总之，上述研究结果表明，熊果酸具有显著抑制多种肿瘤疗效，但熊果酸抗肿瘤作用的分子机制涉及到对不同的基因和细胞信号通路的调节，以及细胞周期的变化，并且这些调节作用相互交叉，共同产生抑制肿瘤的作用。

熊果酸通过多因素、多环节相互作用发挥抑制肿瘤作用。然而，熊果酸难溶于水，且剂型较为单一，口服药物的生物利用率较低，限制了其在临床抗肿瘤方面的进一步应用[35]。近期文献报道，Jin等[12]制备装载UA的壳聚糖纳米颗粒(CH-UA-NPs)具有抗血管生成和抗肿瘤作用。这种合成CH-UA-NPs可以节省大约10倍的UA剂量，这意味着可以显著降低高剂量UA对人体的引起的药物不良反应。Wang等[36]研究表明，熊果酸纳米粒子抑制宫颈癌细胞增殖，是通过诱导细胞凋亡来实现，这可能是一个潜在未来临床治疗策略。