lncRNA-HULC在肝细胞癌中的作用

刘熙称，刘广明，秦俊杰

吉林大学第一医院消化内科，吉林 长春 130021

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作为世界上第六大最常见的恶性肿瘤，尽管在HCC治疗方法的开发方面取得了巨大进步，目前仍是第二大最常见的肿瘤相关死亡原因，因此，确定HCC发生、发展的分子机制对于早期诊断，选择治疗方法及评估预后至关重要[1]。最近非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，特别是长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)成为生物标志物和治疗靶点研究的重点。2007年在HCC中首次发现第一个高度特异性上调的ncRNA，被称为在肝癌中高度上调的基因(highly up-regulated in liver cancer，HULC)，是一种新型的mRNA(messenger RNA)样lncRNA。该基因位于6p24.3染色体上，长度约为500个核苷酸，并包含两个外显子，具有蛋白质编码基因的剪接、聚腺苷酸化、胞质定位和与核糖体结合的特性，但整个基因中均有大量的终止密码子，且转录的RNA缺乏实质性的开放阅读框架及复杂的二级结构不可能进一步翻译成蛋白质[2]。研究发现，lncRNA可通过调控表观遗传、细胞周期和细胞分化在肝癌发生及发展、血管侵袭和远处转移中起关键作用[3]。本文对lncRNA-HULC在HCC中的作用作一概述，以期能够探索HCC遗传层面的分子机制和开发新的潜在的生物标志物及治疗靶标，为HCC的治疗和药物设计提供新的线索。

1 在HCC进展过程中的作用

lncRNA通过尚未完全了解的机制参与HCC的发生发展过程。一方面，lncRNA在染色质调节、转录调节和可变剪接调节中发挥关键作用。另一方面，lncRNA还可以通过充当竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)来调控miRNA从而影响mRNA的稳定性和翻译调控[4-5]。

1.1 HULC在HCC进展过程中的作用尽管许多癌症类型中HULC过表达的潜在机制仍不确定，但新兴证据表明，环境和宿主因素之间在HULC表达调节中存在复杂的相互作用[6]。众所周知，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC的主要原因。研究发现，在两种产生HBV的HCC细胞系中HULC上调，HULC在HCC发生过程中可被HBV诱导，HULC水平与HBV X蛋白(HBV X protein，HBx)密切相关，后者是一种致癌病毒蛋白，在HCC和非肿瘤肝组织中介导HBV致病性的许多方面，在这方面，HBx诱导了HCC的发生[6]。HULC通过HBx共激活的信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)促进miR-539的表达，而miR-539下调载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3B，APOBEC3B)的表达，导致共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的增加，后者是HBV复制的模板，维持了病毒感染的持续性[7]。即HULC通过HBx/STAT3/miR-539/APOBEC3B信号传导激活HBV复制，从而导致HCC细胞的生长[8]。

真核翻译延伸因子1ε1(eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1，EEF1E1)是大分子氨酰基-tRNA(transfer RNA)合酶复合物的骨架，在DNA损伤后转移到细胞核中介导p53的活化，充当肿瘤抑制因子。Yu等[6]发现，HULC可以通过下调EEF1E1来促进HCC的生长，HCC组织样本中HULC和EEF1E1的水平之间呈负相关，敲低HULC则增加启动子活性和EEF1E1的表达。最重要的是，EEF1E1的上调可以挽救HULC敲低的肿瘤抑制作用，其本身足以促进体内HCC的生长。鞘脂是细胞增殖的重要生物活性分子，鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)对鞘脂水平的调节在致癌作用中起着至关重要的作用。HULC水平与肝癌中SPHK1及其产物鞘氨醇-1-磷酸的水平呈正相关，敲低SPHK1可以消除HULC增强血管生成的作用[9]。细胞昼夜节律的破坏(即基因表达的周期性改变)与HCC发生有关。HULC可以通过与CLOCK mRNA的5'UTR相互作用来上调昼夜节律调节器-CLOCK并扰乱其在HCC中的节律性表达，敲除CLOCK能够消除HULC过表达对体外细胞增殖及体内HCC异种移植生长的刺激作用[10]。上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞获得间质特性的过程，其特征是细胞间黏附减少、运动性和侵袭性增强，其在肿瘤的进展和转移中起着关键作用。在HCC中已证明HULC对EMT的正向调节表现为上皮标志物(如E-钙黏蛋白)的下调和间充质标志物(如波形蛋白)的上调[11]。长链脂酰辅酶A合成酶1(acyl-Co A synthetase1，ACSL1)是启动长链脂肪酸代谢至关重要的酶，HCC中HULC的水平与ACSL1的水平呈正相关，其中HULC的miR-9的表观遗传沉默抑制了转录因子PPARA(一种在HCC细胞中具有配体依赖性转录活性的核类视黄醇受体)，从而诱导了ACSL1的表达。而敲除ACSL1可降低裸鼠中甘油三酸酯和胆固醇的水平及HCC异种移植物的生长。

1.2 充当ceRNA在HCC进展过程中的作用lncRNA通过充当ceRNA抑制肿瘤的miRNA的表达，阻碍了miRNA目标的抑制或降解，致癌mRNA的翻译增加是其结果，从而增强了癌细胞的特性(增殖、迁移和侵袭等)[12-13]。如通过隔离miR-124，HULC参与了内皮细胞的血管生成[14]。

外泌体在HCC的进展中起关键作用，有研究报道称外泌体miR-335可能是一种新的HCC治疗策略[15]。Cao等[16]调查了HULC在血清来源的外泌体和肝组织中的表达，通过分析HULC表达与其他RNA的相关性，证明了HULC表达的增加与HCC细胞增殖和侵袭增加、凋亡减少有关，并发现HULC可以作为miR-372-3p的ceRNA起作用，从而抑制Rab11a的表达。Rab蛋白是细胞内膜运输的关键调节剂，据报道Rab11a促进外泌体的分泌。

HCC中HULC表达增加的后果的早期机理研究表明，cAMP反应元件结合蛋白(element-binding protein，CREB)参与其中，在HULC启动子区域中存在CREB结合位点，并且CREB能够激活HULC启动子，因此可以在转录水平上控制HULC表达[12]。进一步的实验表明，miR-372通过直接靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)来增强Y-box结合蛋白1(phosphatase and tensin homolog，YB-1)的表达，并因此通过依赖于PTEN的HULC环促进YB-1的磷酸化[17]。随后，有研究报道miR-203可以下调HULC及整合素和金属蛋白酶9(a disintegrin and metalloproteinase 9，ADAM9)，从而控制HCC进程，证明了另一种miRNA的参与[18]。

Hu等[19]研究表明，miR-488在HCC组织中显著下调，miR-488的上调在体外抑制细胞增殖、侵袭和EMT。ADAM9充当miR-488的直接靶标通过降低的miR-488表达，从而在HCC中诱导细胞增殖和侵袭。而HULC是HCC细胞中miR-488的靶标，且miR-488通过在HCC中海绵化HULC从而抑制其表达，起到抑制HCC的作用[20]。在HCC中，HULC与PTEN或miR15a的表达呈负相关，HULC通过降低成熟的miR15a增加P62的表达。另一方面，过量的HULC会在转录水平上增加微管相关蛋白1轻链(microtubule-associated protein 1 light chain，LC3)的表达，然后通过沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，Sirt1)激活LC3。最终HULC通过抑制HCC中的PTEN激活AKT-PI3K-mTOR途径[21]。Li等[22]发现，HULC充当miR-200a-3p的分子海绵，导致EMT激活剂ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)上调，ZEB1介导的EMT是侵袭和转移形成的必要条件。

2 作为潜在的生物标志物的应用

生物标志物被定义为指示相应疾病或适于预后或治疗效果预测分子存在的可检测和可测量的生物分子。血浆肿瘤标志物检测是早期筛查患者并预测预后的理想方法。目前，血浆甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是HCC中最广泛使用的肿瘤标志物，但AFP受其低敏感性和特异性的限制[23]。因此，迫切需要寻找一些新的具有高敏感性和特异性的肿瘤标志物来检测HCC的肿瘤发生和复发。随着全基因组和转录组测序技术的发展，许多lncRNA被证明在肿瘤组织中高表达。由于lncRNA的时间和组织特异性表达，癌基因和肿瘤抑制因子在转录和转录后水平上的调控功能及它们在癌细胞中的异常表达，从而促进了癌细胞特性(如增殖、侵袭)的发展，最有望成为癌症生物标志物[24]。自HULC发现以来，许多研究突出强调了这种lncRNA作为HCC生物标志物的巨大潜力，一方面，在患者的血浆和癌组织中可检测到HULC水平升高，并且与临床病理特征例如整体存活率、肿瘤分期和复发率有关。另一方面，在相应的癌细胞系中可检测到强烈上调的HULC水平。非侵入性生物标志物的优点是显而易见的，便捷的样品回收和制备及减轻患者的痛苦等备受关注。有研究通过进行受试者工作特征曲线分析发现，HULC是具有良好诊断准确性的HCC诊断的最佳生物标志物[25]。而李双良等[26]的实验进一步指出HULC的表达量可作为诊断早期HBV相关肝癌的潜在标志。除高表达水平外，HULC基因内的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)还与危险分层有关。SNP rs7763881的变异基因型有助于降低HBV持续携带者对HCC的易感性，它的保护作用与其相关的HULC表达水平的降低有关[27]。SNP rs1041279被证明与HCC风险增加1.41倍相关[28]。通过研究了在切除的158例HCC中lncRNA的表达水平，Sonohara等[29]发现，HCC组织中HULC的表达增加代表了治愈性HCC的良好预后生物标志物，测定HULC表达水平能够更准确地预测HCC预后。

3 作为潜在的治疗靶点—lncRNA的靶向策略

证据表明，自噬在肿瘤化疗耐药性中起重要作用[30]。Xiong等[31]首次证明了用抗肿瘤药(如奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和吡柔比星)处理可显著诱导HULC表达和保护性自噬。通过抑制保护性自噬，使HULC敏感化的HCC细胞对这三种抗肿瘤药物沉默。HULC的异位表达通过稳定Sirt1蛋白引起HCC细胞自噬。对HULC稳定Sirt1的相应机制的研究表明，HULC上调了泛素特异性肽酶22(ubiquitin-specific peptidase 22，USP22)，从而通过从Sirt1去除缀合的多泛素链减少了泛素介导的Sirt1蛋白降解。此外，还发现miR-6825-5p、miR-6845-5p和miR-6886-3p可以通过与USP22 mRNA的3′-未分支区域结合而降低USP22蛋白的水平，而HULC可以下调这3个miRNA，从而导致USP22升高。通过“HULC/USP22/Sirt1/保护性自噬”途径减弱了HCC细胞对化疗药物的敏感性，表明该途径可能是开发针对HCC化疗的敏感化策略的新靶标。

lncRNA在癌症的发病机理中扮演不可或缺的角色，因此对抗这种破坏性疾病代表了最有潜力的治疗靶标[32-33]。致癌lncRNA可以通过靶向其一级结构而降低RNA水平(如小干扰RNA和反义寡核苷酸)。规避lncRNA介导的致癌作用的另一种策略是通过向系统中引入小分子抑制剂来掩盖lncRNA的结合位点，从而阻止与其配体的缔合，达到抑制lncRNA与其靶分子结合的目的。有报道发现，通过破坏lncRNA二级结构正确折叠模式的建立可以发挥抗癌作用[34]。通过使用适体靶向lncRNA的二级结构，可以消除lncRNA的致癌作用。适体是通过形成三级结构结合其靶标的单链DNA或RNA寡核苷酸，它还能够克服lncRNA的结构特征引起的限制[12]。在癌组织和细胞中表达的特异性是靶向HULC最大的优势。

4 未来展望

自HULC发现以来，大量研究证明了HCC中HULC的显著上调，HULC表达升高与癌症患者的临床病理特征(即肿瘤分期、淋巴结或远处转移的发生、复发率、预后)密切相关。与其相应的癌细胞系支持的体外实验和体内试验突出强调了HULC上调在促进肿瘤发生和调节癌细胞特性(如增殖、迁移、侵袭、自噬和耐药性)中的重要作用。从致癌机制上讲，HULC常常使抑制肿瘤的miRNA变海绵状，从而导致致癌mRNA水平增加，然后转化为驱动致癌作用的致癌蛋白。HULC符合生物标志物标准，是潜在的生物标志物：大多数研究均报道在HCC患者组织和血浆中HULC的高度增加。HULC不仅是有价值的生物标志物，更是预测和诊断及治疗目标的曙光。虽然HULC是治疗癌症患者的有希望的候选靶标，但仍需更多的研究来进一步阐明其潜在的分子机制，尤其是在非HCC类型的癌症中。更需要进行针对优化的HULC靶向方法的后续研究，以阐明靶向该lncRNA的最佳方法。通过进行大量深入的研究，为前瞻性研究奠定坚实的基础，相信lncRNA-HULC在未来将发展成为可靠且有希望的治疗目标。