四氯化碳溶液构建肝纤维化大鼠模型研究进展*

蔡碧莲，文亦磊，罗伟生△

1.广西中医药大学（南宁530001）；2.广西中医药大学第一临床医学院（南宁530023）

肝纤维化是指肝脏在受到各种因素，如生物、化学、物理等因素的损伤作用下，细胞外基质异常合成增多与降解不足所引起的病理过程。当这一病理过程持续发展，肝小叶的结构会发现改变，随之而来的是结节及假小叶的形成，最终会发展为肝硬化甚至肝癌。因此，在“肝炎-肝硬化-肝癌”这三个环节中，肝纤维化起着非常关键的作用。据文献报道［1］，治疗肝纤维化的有效方法为清除病毒、减少致病因素对肝细胞的损伤，从而恢复肝脏正常结构和功能。研究表明［2］，在肝脏受到轻度损伤的情况下，若积极治疗和调护，肝纤维化是可逆的。大鼠肝纤维模型的建立，是研究肝纤维化的发病机制、发生发展病理过程的首要前提，也是为临床研究中医药防治肝纤维化的基础。

1 四氯化碳对肝损伤的作用机制

四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4），别名四氯甲烷，是一种极易挥发且会使人产生愉悦感的无色透明液体。与水互不相溶，但在某些有机溶剂中有较好的溶解性，如脂肪、油类等。可由口鼻、咽喉、食道和皮肤吸收。正是因为它可对肝脏产生毒性作用，使肝细胞结构形态发生改变，甚至引起肝细胞凋亡坏死。因此作为诱导大鼠肝损伤模型，它是最为常用的化学溶剂［3］。据文献报道［4］，CCl4属于自由基毒理学-肝毒物作用机制中的直接肝毒物，其作用原理:①CCl4直接作用于细胞膜、细胞器膜，引起膜脂质发生过度氧化、膜蛋白发生变性、膜结构遭到损伤，从而使肝细胞坏死。②CCl4穿透过线粒体膜，随后线粒体膜发生肿胀变形后导致脂肪酸β一氧化碳降低，由于脂肪酸得不到氧化作用，则会转化为甘油三酯，脂类物质沉积在细胞质之中，从而引起细胞发生脂肪变性。③在细胞色素酶P4502E1（CYP2E1）的诱导作用下的CCl4降解为CCl3—，引起肝小叶中央区的肝细胞发生凋亡坏死，与此同时吞噬细胞和炎性细胞清除坏死区域，肝星形细胞转化为成肌纤维细胞，促进纤维化的发生。

2 构建肝纤维化大鼠模型与皮下注射四氯化碳的时间和剂量

根据药理学和代谢学的研究［5］，CCl4进入大鼠体内2 h后，肝功能指标会明显升高直至24 h 后达到最大值，而后降低，至72 h后恢复正常。基于这一代谢原理，2次／周进行肝纤维化模型构建被许多实验者所采纳。根据CCl4的毒性药理学研究发现［6］，在一次皮下注射建模过程中，肝脏受到损伤的过程是发生在第6、24小时，而肝脏修复的阶段是在第48小时至2周，在12周内则会引起肝纤维化形成。因此，8～10周是常规构建肝纤维化大鼠模型的周期。大多数实验者都选用橄榄油、花生油等油脂溶液溶解CCl4。口服、吸入、皮下注射、腹腔注射［7］是目前实验者经常选择的造模方式。有实验研究表明［8］，考虑给药途径、时间和剂量的不同，肝细胞损伤和炎症反应也不同，模型建成的周期亦不同，但在第6～9周时，基本可见纤维化形成。王晓红等［9］采用剂量为0.3 ml／100 g的50%CCl4植物油溶液皮下注射大鼠，2次／周，发现大鼠肝脏炎症和纤维组织增生程度，与实验周期有关。20周后，大鼠正常肝小叶结构消失，纤维组织增生，可伴有纤维桥连，或形成假小叶。

3 构建肝纤维化大鼠模型与四氯化碳注射方式的选择

有研究发现［10］，腹腔注射CCl4后检测生化指标，4～6 h后血清ALT、AST 值较前升高至5～6倍，在24 h后开始下降，提示腹腔注射CCl4的吸收速度快。腹腔注射CCl4常发生皮肤溃烂，而且其导致的死亡率也明显高于皮下注射［11］。因此，虽然腹腔注射比皮下注射吸收速度快，但若是实验者操作不够娴熟，可能误将CCl4注射至腹腔内的其他脏器，反而会影响实验结果。综合考虑到以上各种情况，从大鼠的存活率、死亡率、成模率等因素来分析，在注射方式的选择上，通过皮下注射CCl4进行肝纤维化大鼠造模，其存活率、成模率比腹腔注射高，而死亡率比腹腔注射低。这样一来，使实验数据更加可信，也缩短了总的实验时间，并且能减少不必要的实验消耗。

4 注射方式与大鼠一般情况

安祯祥等［12］实验发现，在构建模型前，各组大鼠的体质量差异并无统计学意义（P＞0.05）；在构建肝纤维化大鼠模型过程中，发现腹腔注射造模组大鼠一般情况较差，精神不振，反应迟钝，行为迟缓，纳差，皮毛枯燥无光泽，体质量增长缓慢，差异有统计学意义（P＜0.05）；与之相反的皮下注射造模组一般情况较好，精神可，反应较灵敏，行为激进，食量较多，体质量有增长的幅度，差异有统计学意义（P＜0.05）。造成此差异的原因可能是注射CCl4后大鼠肝脏细胞发生炎症或坏死凋亡，进而引起形态、行为上的改变。张磊等［13］研究发现，皮下注射50%CCl4混合溶液，在用药第6周后，大鼠的一般情况逐渐好转，考虑可能与大鼠对CCl4混合溶液毒性药物产生的耐受相关。从大鼠的一般情况进行考量，皮下注射的造模方式优于腹腔注射。

5 皮下注射四氯化碳与肝纤维化检测指标

在建模第10 周后，取腹主动脉血，检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、III型前胶原（PCⅢ）、IV 型胶原（IV-C）、层粘连蛋白（LN）及透明质酸酶（HA）含量，切取肝组织做病理学检查，进行苏木精-伊红（HE）及Masson染色，病理观察。按照《病毒性肝炎防治方案》［14］，通过显微镜观察肝细胞炎症及纤维化增生程度，以肝纤维化分期标准进行分期，直至肝纤维化分期达2期以上，即说明大鼠肝纤维化模型构建成功。陈刚等［15］通过实验观察发现，上述大鼠血清学指标与肝纤维化程度呈正相关关系。换言之，大鼠肝纤维化程度越严重，则其血清学指标也会呈递增趋势。在病理切片中显示早期肝硬化（S4期）的时候，血清指标呈递增趋势，肝功能和肝组织损伤程度也随之加重。考虑这些血清指标可能是细胞外基质沉积与降解的综合反映。由于细胞外基质的降解作用尚未降低，内皮细胞修复功能尚未受到破坏，所以在S1～S2期血清指标上升幅度较小。同理推测，S3、S4期的血清指标会出现明显上升，是因为细胞外基质合成出现异常，内皮细胞功能受损，导致细胞外基质的降解也出现异常。虽然两者有一定的联系性，但上述血清指标并不能准确区分S1、S2、S3、S4期的肝纤维化程度。但其中，有几项数值的变化，可推测注射CCl4后大鼠肝脏的改变。如:AST 数值的升高，反映了肝细胞线粒体受到一定程度的损伤；ALT 数值的升高，则是反映肝脏合成功能受到一定的破坏。

6 停止四氯化碳注射与大鼠肝纤维化的发展趋势

有研究发现［16］，停止注射CCl4的大鼠，其肝纤维化有自愈的趋势。还有实验发现［17］，造模到达肝纤维化后，大鼠行为状态并未出现明显的变化，也没有明显的肝硬化症状（腹水、肝功能异常），但停止注射CCl4一段时间后，通过解剖大鼠腹腔，仅见少许腹水等肝功能失代偿的表现。出现严重的肝纤维化甚至肝硬化，可能是因为CCl4注射剂量过多或者建模周期过长所导致。

7 构建大鼠肝纤维化过程中大鼠死亡的原因

在构建大鼠肝纤维化模型过程中，大鼠的死亡是不可避免的，若是死亡率过高，则会影响实验结果，造成实验结果误差，从而影响实验数据的统计。所以分析并总结大鼠死亡原因在所难免。原因如下:①若是在建模过程中，由于操作不当，原本是皮下注射却不慎将CCl4注入血管使CCl4进入血液循环，引起急性中毒，大鼠会在数分钟后出现死亡。②未按照相应体重注射相应剂量的CCl4，导致输入剂量过大，或CCl4浓度过高，也可引起大鼠死亡。③因个体的差异，耐受力的不同，在24 h后肝脏损伤达到高峰期，若大鼠发生急性肝衰竭，在2～3 d也会出现死亡。④因CCl4是有毒溶剂，注射创口易发生溃烂，甚至伤及至腹膜或腹腔脏器，从而引起大鼠感染致死。⑤注射CCl4导致大鼠性情改变，发生撕咬行为，也会致使大鼠感染而亡。因此，在实验过程中应及时总结分析大鼠死亡原因，尽量避免在后续实验过程中再出现大批量的死亡，为实验顺利进行及实验结果的可靠性打下良好的基础。

8 前景与展望

是否能成功地构建大鼠肝纤维化模型是研究肝纤维化的发病机制、发病经过及如何治疗肝纤维化的重要前提条件。实验者通过以下方法，构建大鼠肝纤维化模型，如:运用刀豆素A［18］，胆 管结 扎 术［19-20］，注 射 猪 血 清 或 人 血 白 蛋 白［21-22］，血 吸虫［23］，酒精［24］、四氯化碳［25］，这些实验方式，分别会引起免疫性肝损害，胆汁郁积，自身免疫性肝纤维化，感染，中毒性肝损害，从而形成肝纤维化模型。CCl4所构建的肝纤维化动物模型是这些方法中造价成本相对低廉且实施方法相对简易，并且是最经典、最早、运用最广泛、也最受实验者和研究者钟爱的方法之一。其中皮下注射CCl4进行造模，操作简易，大鼠死亡率低，成模率高，与自然生活环境更贴近，便于研究抗肝纤维化作用机制，因而更广泛应用。但由于CCl4是有毒溶剂，又因造模周期长，在用药时要注意中毒剂量和观察大鼠活动状态，也因CCl4有自愈趋势，应根据实验情况随时予以调整，这方面值得进一步深入研究。