雷公藤甲素普朗尼克混合载药胶束的制备

桂荣，曹瑞珍，金玲玲，尹美珍

（内蒙古民族大学 医学院，内蒙古 通辽028000）

聚合物胶束是由两亲性嵌段共聚物分子在水溶液中自组装成的具有亲水性外壳和疏水性内核的胶体分散系，不仅能增溶药物，还可以延长药物在体内的循环时间，提高生物利用度，并且可以依赖于肿瘤组织的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）［1-4]，实现药物向肿瘤部位的被动靶向，从而降低药物的全身毒性.近年来，出现了大量有关聚合物胶束的研究报道.普朗尼克是一种结构简单、来源方便、成本低的两亲性三嵌段共聚物，由聚氧乙烯（PEO）、聚氧丙烯（PPO）组成，PPO 和PEO嵌段比例不同构成多种不同型号的普朗尼克.普朗尼克在水溶液中自组装形成“核-壳”结构的纳米聚合物胶束.普朗尼克两端PEO 嵌段的羟基，很容易对其进行化学改造［5，6]，实现药物向肿瘤细胞的主动靶向.此外，普朗尼克还具有多种途径的逆转肿瘤耐药性作用［6].因而，普朗尼克作为载体材料得到了广泛关注.研究报道了多种单一普朗尼克F127、P85、P105 载药胶束［7-9]，以及双普朗尼克F127/P105、F127/P1123、F127/L61载药胶束［10-12]，用于靶向递送阿霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤、多西他赛等多种化疗药物.研究发现两种不同普朗尼克的亲水和疏水嵌段之间相互作用，可增加递药系统的稳定性，不受血液稀释的影响［13]，可以解决单一普朗尼克胶束因在血液大量稀释后药物提前释放的问题.

雷公藤甲素（Triptolide，TPL）是从传统中药雷公藤中分离的一种双萜类化合物，具有抗风湿、抗老年痴呆、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤，免疫调节、保护神经元和心血管等多种药理作用，其抗肿瘤作用倍受人们关注.研究证明TPL的抗肿瘤活性相比传统化疗药物顺铂、丝裂霉素和紫杉醇更强［14].但同时对消化、泌尿和血液系统等也表现出较大的毒副作用，因而限制了其在临床上的应用.

普朗尼克F127和F68作为多功能药用辅料被收载于中国药典和美国药典中，具有良好的生物相容性和安全性.因此，本实验选择普朗尼克F127 和F68 作为载体材料，采用薄膜水化法制备双普朗尼克胶束，装载疏水性的雷公藤甲素，并研究其载药量和包封率，为雷公藤甲素的靶向递送提供合适的载体，并为进一步多功能载体研究打下基础.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

普朗尼克F127、F68（BASF，Ludwigshsfen，Germany），雷公藤甲素（Triptolide，纯度98.5%，Aladdin），雷公藤甲素对照品（中国药品生物制品检定所）.

1.2 F127/F68-TPL混合载药胶束的制备

采用薄膜水化法制备聚合物载药胶束.称取一定量的载体材料，即普朗尼克F127和F68，以及适量的疏水性药物雷公藤甲素（TPL），无水乙醇使其充分溶解，氮气流蒸发将有机溶剂蒸干，真空干燥过夜，得干燥透明的一层薄膜（药膜）；然后加一定量的去离子水，在一定的水浴温度下，在300 rpm转速下恒速搅拌30 min，进行水化，冷却至室温，10000 rpm 离心10 min，用无菌0.22 μm 醋酸纤维素滤膜过滤，得到透明的普朗尼克-雷公藤甲素聚合物胶束溶液，冷冻干燥可得到冻干粉.

1.3 载药量和包封率测定

采用RP-HPLC 法测定F127/F68-TPL 中TPL 的含量.（1）色谱条件：反相色谱柱（Agilent，C18，150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇：水=30∶70；流速0.8 mL/min，检测波长213 nm；柱温30℃，进样量20μl.（2）采用TPL对照品，建立标准曲线y=34.23 x-54.88（R2=0.9994）.TPL在0.1～50 μg/mL浓度范围内，色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系.该方法专属性良好，普朗尼克对TPL检测无干扰.（3）样品溶液的制备及测定.精密量取一定量载药胶束溶液，加一定量甲醇稀释，混匀，漩涡l min，10000 rpm离心10 min，取上清液，0.45 μm微孔有机滤膜过滤，取滤液20 μL注入色谱仪，测定主成分的峰面积.（4）根据如下公式计算载药量（Drug Loading，DL）和包封率（Encapsulation rate，ER）.DL%=胶束中药物的重量/所加聚合物和药物的总重量×100%，ER%=胶束中药物的重量/所加药物的重量×100%.

1.4 单因素考察

载体材料质量为200 mg，以ER%及DL%为指标，对薄膜水化法中的可变因素进行考察.

1.4.1 混合载体F127和F68的质量比考察将TPL投药量固定为5 mg，水化温度50 ℃，加水量分别为5 mL，10 mL和20 mL，考察F127的质量分数为33.3%、50%、66.7%和100%时，对DL%和ER%的影响.

1.4.2 投药量考察

F127和F68各为100 mg，水化温度50 ℃，加水量10 mL，考察TPL投药量为3 mg、5 mg、7 mg、8 mg和9 mg时，对DL%和ER%的的影响.

1.4.3 加水量考察

F127和F68各为100 mg，TPL投药量为5 mg，水化温度50℃，考察水化时用水量分别为5、10、15、20、25 mL时DL%和ER%的变化.

1.4.4 水化温度考察

F127 和F68 各为100 mg，TPL 投药量为5 mg，用水量为10 mL，考察水化温度分别是30℃、50℃、70℃、80℃和90℃时，对DL%和ER%的影响.

1.5 水化温度对胶束泄漏药物的影响

将1.4.4制备好的载药胶束溶液恒温水浴振荡（37℃，100 rpm）48 h后，再取样RP-HPLC法测定载药胶束中TPL的含量，计算TPL的泄漏量即TPL的沉淀百分数.根据公式计算TPL的泄漏量.

泄漏量（%）=（原胶束中药物的含量-震荡放置后胶束中药物的含量）/原胶束中药物的含量×100%

1.6 优化工艺验证

通过单因素考察，以及水化温度对泄漏量影响的考察，综合考虑ER%值和DL%值，优化薄膜水化法的制备工艺，当载体量200 mg，F127与F68的质量比为1，TPL投药量8 mg，加水量20 mL，水化温度50℃时，DL%和ER%的值均较高.

2 结果

2.1 载药量和包封率的影响因素

2.1.1 载体质量分数对包封率和载药量的影响

见图1a，图1b.当TPL 的投药量为5 mg，水化温度50℃，加水量分别为5 mL 时，随F127 质量比的增大，DL%和ER%的值均逐渐增大；而当水量分别为10 mL 和20 mL 时，随F127 质量比增大，DL%和ER%的值均没有明显变化.但是，随水量增多，相应的DL%和ER%值均增大.此结果说明加水量不足时，混合载体中F127的质量分数不同对胶束的载药量和药物的包封率有影响，而当水量达到一定程度时，则没有明显的影响.

2.1.2 投药量对包封率和载药量的影响

见图2.当水量为10 mL时，随投药量的增加，载药量呈现明显先上升趋势，而包封率则呈现明显下降趋势.结果表明投药量对胶束的载药量以及药物的包封率影响较大，增加投药量可提高载药量，但可能会降低包封率.

2.1.3 加水量对包封率和载药量的影响

见图3.当加水量为20 mL 以下时，随加水量的增加，载药量和包封率均逐渐升高，当加水量达到20 mL以上时，水量增加，载药量和包封率均逐渐降低.表明加水量对载药量和包封率有较大的影响，提高加水量可提高胶束的载药量以及药物的包封率，最佳水量为20 mL.

2.1.4 水化温度对包封率和载药量的影响

见图4.水化温度在30～80℃的温度范围内，随温度升高载药量和包封均增大，而温度达到80℃～90℃时，ER%值和DL%值又均降低.因此，水化温度对ER%值和DL%值又较大影响，提高水化温度可提高胶束的载药量以及药物的包封率，但水化温度越高，静置于室温后，吸附于疏水内核的药物分子可能越易泄漏.

2.2 水化温度对泄漏量的影响

见图5.水化温度越高，药物在胶束上48h内的泄漏量越高，尤其是水化温度达80℃以上，药物泄漏的百分比更大.

2.3 优化制备工艺

F127 与F68 各100 mg 时，采用薄膜水化法的优化工艺，TPL 投药量8 mg，加水量20 mL，水化温度50℃，制备得载药胶束F127/F68-TPL，其载药量为3.47%，TPL 的包封率为90.09%.此优化的制备工艺获得较高的胶束载药量和药物包封率.

3 讨论

胶束的制备方法主要有透析法、薄膜水化法和乳化溶剂蒸发法［7].薄膜水化法是比较简单而方便的制备方法，且该方法的应用最为广泛.本实验采用薄膜水化法制备了F127/F68-TPL 混合载药胶束，通过单因素考察发现，当加水适量时，F68和F127的质量比对胶束的载药量和药物的包封率没有显著影响.由于混合普朗尼克可以避免大量血液稀释导致药物早泄［13]，因而本实验选择F68和F127的质量比为1：1制备载药胶束.单因素考察结果还表明投药量、加水量以及水化温度对胶束的载药量和药物的包封率均有较大的影响，不同的制备工艺条件得到不同的载药量和包封率，尤其水化温度的提高对载药量和包封率的提高更为明显.本实验中水化温度对泄漏量影响的实验结果表明：在50～90℃的水化温度中以50℃可以得到最稳定的载药胶束.因此，通过单因素分析，综合考虑载药量、包封率以及泄漏量，进行制备工艺的优化，提高载药胶束的载药量.在此基础上可以采用星点设计-效应面法最优化载药胶束的制备工艺，并通过验证进行确定.

TPL的抗肿瘤活性较强，有研究证实其对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用，平均使用浓度为12 nM［15].由于TPL的使用浓度极低，即使F127/F68-TPL的载药量最低为1%，也能远远满足制剂的使用要求.

总之，本实验制备的F127/F68-TPL混合载药胶束，载药量虽低，在1.3%～3.5%之间，但对于使用剂量较低的药物，需要较低含量的制剂.此外，薄膜水化法制备方法简单易行，载体材料经济可得，制备的双普朗尼克载药胶束稳定.因此，普朗尼克F127/F68为载体材料的混合胶束可以作为TPL的靶向递送载体.