辣木叶多酚的超声辅助双水相提取工艺优化及其抗氧化活性评价

董 乐，王 芳，李小琴，梁文文

（泉州师范学院 海洋与食品学院，福建泉州362000）

植物多酚（plant polyphenol）为广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的一类次级代谢物［1]，具有诸如抗氧化性、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗骨质疏松、抑制心血管疾病、降血脂和降血糖等多种生物活性［2-7]，因对健康的有益作用而备受关注［8].植物多酚的提取主要采用水溶液或者醇水溶液室温冷浸等传统方法，但提取率较低［9-10].双水相萃取体系是由两种互不相溶的水溶液组成［11]，是根据两相间的选择分配不同进行提纯，提取环境温和，不会导致生物活性物质的变性或是失性，传质速率快，能够实现快速分离［12].近年来，采用双水相萃取技术从不同植物中提取多酚化合物研究的报道很多［13].在溶液萃取体系基础上，采用超声波、微波等辅助提取方法能够有效提高植物多酚的提取率和纯度.超声波辅助提取技术因具有特殊的作用机制，能够获得理想的提取效果，故备受关注［14].植物化学成分的提取和纯化工艺涉及多种影响因素.响应面法（RSM）是利用合理的试验方法并通过试验得到一定的数据，将各因素与响应值之间的函数关系以多元二次回归方程方式进行拟合，通过对回归方程和响应面分析获得最佳工艺条件［15].该方法可以快速而有效地确定多因素系统的最佳条件，并已应用于多种优化实践中［16-18].

辣木（Moringa oleiferaLam.）又称鼓槌树（Drumstick tree），为辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa）的多年生热带落叶乔木，目前广泛分布于印度、中国、日本等30多个热带及亚热带的国家和地区［19].辣木富含多酚类化合物［14].对辣木籽的多酚提取工艺研究已有报道［20-23]，但均是以乙醇或正丙醇单一溶剂作为提取剂［24-26].且一般就利用度而言，辣木叶相对较高.本试验以多酚提取率为评价指标，以硫酸铵用量、正丙醇体积分数、液料比、超声时间和超声温度为自变量，在单因素试验基础上通过与响应面法中的Box-Behnken 设计优化辣木叶多酚的超声波辅助正丙醇-硫酸铵双水相提取工艺；通过抗氧化能力指数（ORAC）和对羟基自由基（OH·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS·+）的清除能力来评价其抗氧化活性，从而为辣木叶多酚的高效提取及辣木叶的精深加工利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料 辣木由福建安溪师竹轩园艺有限公司提供.

1.2 试验试剂 水溶性维生素E（Trolox，生物级）：美国Sigma-Aldrich 公司；偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH，生物级）、DPPH·（生物级）、ABTS·+（生物级）：aladdin 公司；荧光素钠（FL，生物级）：上海MACKLIN 公司；没食子酸标准品（GAD，分析纯）：中国药品生物制品鉴定所；Folin-Ciocalteu 试剂（分析纯）：美国sigma公司；其余试剂（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司.

1.3 仪器设备 3635 型96 孔紫外微孔板：美国Corning 公司；酶标仪：Infinite PROM-200 型，瑞士Tecan公司；紫外-可见分光光度计：TU-1950型，北京普析通用仪器有限责任公司；梯度混合器：TH-1000型，上海青浦沪西仪器厂.

1.4 方法

1.4.1 辣木叶粉末的制备 辣木叶用自来水清洗，并自然风干.经高速粉碎机粉碎，将过80目筛后的辣木叶粉末装袋，置于干燥器中保存，备用.

1.4.2 水分含量的测定 按中华人民共和国国家标准GB 5009.3-2016测定［27].

1.4.3 双水相体系的构建 称取一定质量的硫酸铵，用去离子水溶解后加入正丙醇，充分混合直至两相形成［28].

1.4.4 多酚的提取流程 称取辣木叶粉末后，在不同提取条件下用超声波辅助双水相法充分混合静置1 h，超声提取，滤过，滤液置于分液漏斗中静置分层后，取上层醇相清液，蒸干，溶解，转移至50 mL容量瓶中，定容，即得供试溶液.

1.4.5 多酚含量测定 按参考文献［29]测定.

1.4.6 提取工艺的单因素试验 通过预试验确定辣木叶多酚粗品单因素的基本条件为：硫酸铵用量为0.3 g·mL-1、正丙醇体积分数（V·V-1）为60%、液料比为20∶1（V·m-1，mL·g-1）、超声提取时间为50 min、超声提取温度为50 ℃.通过改变其中一个变量、固定其他因素不变，分析各个单因素对辣木叶多酚提取率的影响.液料比对辣木叶多酚提取率的影响：称取1.00 g辣木叶粉末，固定超声时间50 min，超声温度60 ℃，正丙醇体积分数为60%，硫酸铵用量为0.3 g·mL-1，分别考察液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1（V·m-1，mL·g-1）水平对多酚提取率的影响.硫酸铵用量对辣木叶多酚提取率的影响：分别考察硫酸铵用量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL-1水平对辣木叶多酚提取率的影响.超声提取温度对辣木叶多酚提取率的影响：分别考察30、40、50、60、70 ℃5个水平对辣木叶多酚提取率的影响.正丙醇体积分数对辣木叶多酚提取率的影响：分别考察正丙醇体积分数（V·V-1）为20%、40%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、100%9个水平对辣木叶多酚提取率的影响.超声时间对辣木叶多酚提取率的影响：分别考察超声时间为30、40、50、60、70 min 5个水平对辣木叶多酚提取率的影响.

1.4.7 提取工艺的Box-Behnken响应面优化试验 根据预试验和单因素试验的结果，固定硫酸铵用量为0.3 g·mL-1，采用统计分析软件Design-Expert 8.0.6 中Box-Behnken Design 试验设计原理设计响应面试验，以超声时间、超声温度、液料比和正丙醇体积分数为自变量，以辣木叶多酚提取率为评价指标，建立4因素3水平的响应面分析法，进行二次多项回归拟合及其优化分析，其水平编码表见表1.

表1 试验因素与水平设计Tab. 1 Experimental factors and level design

1.4.8 辣木叶多酚的抗氧化活性测定 ORAC 的测定按参考文献［30]，OH·清除率的测定按参考文献［31]，ABTS·+清除率的测定按参考文献［32]，DPPH·清除率的测定按参考文献［33].

1.4.9 数据处理 所有试验均为3次重复，结果以平均值±标准差表示.抗氧化试验对照组以等体积维生素C（VC）代替样品溶液其余同样品组.采用Excel 2016和Design - Expert 8.0.6软件进行作图.

2 结果与分析

2.1 辣木叶粉末中水分含量 根据测定的结果，辣木叶粉末中水分含量为3.42%±0.04%.

2.2 多酚含量测定的线性回归方程 根据测定的结果，吸光值A（y）与没食子酸质量浓度（x，μg·mL-1）在0.00～5.83 μg·mL-1内的线性回归方程为y = 0.0846x－0.0090（R2＝0.9992），说明线性关系良好.

2.3 单因素试验

2.3.1 液料比对辣木叶多酚提取率的影响 由图1可知，液料比在20∶1～50∶1（V·m-1，mL·g-1）范围内，随着液料比的增大，辣木叶多酚的提取率随之增大，当液料比提高到50∶1（V·m-1，mL·g-1）时，辣木叶多酚提取率达到最高；当液料比继续提高时，提取率基本保持平缓且略呈下降趋势.这是由于提取过程中随着提取溶剂的增大，传质的动力就越大，使得辣木叶中多酚物质更容易溶出.但是，随着液料比的增大，产生同样热量时提取温度相应会下降，从而使提取率下降［33].因此，辣木叶多酚提取工艺的最佳液料比选择50∶1（V·m-1，mL·g-1）.

2.3.2 硫酸铵用量对辣木叶多酚提取率的影响 由图2可知，硫酸铵用量在0.1～0.3 g·mL-1范围时，辣木叶多酚提取率随硫酸铵用量的增加而增高，当硫酸铵用量达到0.3 g·mL-1时，辣木叶多酚的提取率达到最高.当硫酸铵用量继续增加时，辣木叶多酚的提取率却随之下降.因此，辣木叶多酚提取工艺的最佳硫酸铵用量选择0.3 g·mL-1.

2.3.3 正丙醇体积分数对辣木叶多酚提取率的影响 由图3可知，在不同体积分数的正丙醇与一定质量的硫酸铵形成的双水相体系中，当正丙醇体积分数增加至80%时，辣木叶多酚的提取率达到最高，当正丙醇体积分数超过80%时提取率开始下降，原因可能是因为正丙醇体积分数过大，使亲脂性物质大量溶出，从而使通透性下降，干扰因素也随之增大［34].因此，辣木叶多酚提取工艺的最佳正丙醇体积分数选择80%.

2.3.4 超声提取温度对辣木叶多酚提取率的影响 由图4可知，当超声提取温度在30～50 ℃时，辣木叶多酚的提取率随超声提取温度的升高而增加，提取率在超声提取温度为50 ℃时达最高值.当超声提取温度进一步增加时，辣木叶多酚的提取率却开始降低.其原因在于，超声提取温度超过该范围，可能造成多酚类物质不稳定，会发生降解和（或）部分氧化.因此，辣木叶多酚提取工艺的最佳超声提取温度选择50 ℃.

2.3.5 超声提取时间对辣木叶多酚提取率的影响 由图5可知，当超声提取时间分布于20～50 min时，随着超声提取时间的增加，辣木叶多酚的提取率增高，当超声提取时间为50 min 时多酚提取率达最高值，当提取时间继续增大时，辣木叶多酚的提取率随着时间的增大反而减小.这是因为在刚开始提取时，辣木叶细胞破碎程度增大，辣木叶中的多酚物质逐步溶出，辣木叶中的酚的量是固定的，当达到一定时间后，辣木叶多酚类物质的溶出量接近固有值，因此，即使提取时间继续增加，多酚类物质溶出微乎其微甚至不会溶出；并且随着时间的增加，已溶出的多酚类物质可能会发生氧化，导致多酚提取率的测定值会比实际含量低［35].因此，辣木叶多酚提取工艺的最佳超声时间选择50 min.

2.4 Box-Behnken 响应面试验结果 以提取温度（A）、提取时间（B）、液料比（C）和正丙醇体积分数（D）为自变量，以提取率为评价指标，利用响应面分析法对辣木叶多酚提取工艺进行优化.试验设计、试验结果见表2.

表2 Box-Behnken响应面试验设计及分析Tab. 2 Box-Behnken response surface test design and analysis

根据响应面试验结果（表2），试验结果采用Design-Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合后，建立了A、B、C和D共4因子的数学回归模型为：

对试验结果进行回归方差分析结果见表3.由表3可知，该模型P（Pro＞F）为＜0.0001，表明模型极显著，其失拟项P值是0.0616，表明失拟项不显著，该模型是稳定.由表3的回归系数显著性检验可知，A、B、C、D 4个因素对辣木多酚提取影响极显著（P＜0.01），BC、BD两两交互之间对多酚提取率的影响极显著（P＜0.01），AC、AD两两交互之间对多酚提取率的影响显著（P＜0.05），A2、B2、C2、D2对多酚提取率的影响极显著（P＜0.01）.

表3 回归方程显著性检验和方差分析Tab. 3 Significance test and variance analysis of regression equation

响应面中的等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，见图6～图9.

由图6-A 可知，当提取温度一定时，随液料比的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当液料比为52.5∶1（V·m-1，mL·g-1）时，辣木叶多酚的提取率达最高值；在液料比一定时，随温度的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当提取温度为51 ℃时，辣木叶多酚的提取率达最高值.提取温度和液料比对辣木叶多酚的影响近似椭圆，说明有交互作用（图6-B）.

由图7-A可知，当提取温度一定时，随正丙醇体积分数的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当正丙醇体积分数为78%时，辣木叶多酚的提取率达最高值；在正丙醇体积分数一定时，随温度的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当提取温度为51 ℃时，辣木叶多酚的提取率达最高值.提取温度和正丙醇体积分数比对辣木多酚的影响近似椭圆，说明有交互作用（图7-B）.

由图8-A 可知，当提取时间一定时，随液料比的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当液料比在50∶1（V·m-1，mL·g-1）时，辣木叶多酚的提取率最高；在液料比一定时，随提取时间的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当提取时间为50 min时，辣木叶多酚的提取率最高.提取时间和液料比对辣木叶多酚的影响近似椭圆，说明有交互作用（图8-B）.

由图9-A可知，当提取时间一定时，随正丙醇体积分数的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当正丙醇体积分数为78%时，辣木叶多酚的提取率达最高值；在正丙醇体积分数一定时，随提取时间的增加，辣木叶多酚提取率的变化趋势为先增加后减小，当提取时间为50 min时，继续增加时间辣木叶多酚提取率略有减少，在提取时间为50 min时，辣木叶多酚的提取率达最高值.提取时间和正丙醇体积分数对辣木叶多酚的影响近似椭圆，说明有交互作用（图9-B）.

2.5 最佳工艺及其验证试验 根据上述数学回归模型计算出最佳工艺条件：硫酸铵用量为0.3 g·mL-1，正丙醇体积分数为78%，液料比为52.5∶1（V·m-1，mL·g-1），超声时间为50 min，超声温度为51 °C，预测值为3.17%.在此条件下提取辣木叶多酚，重复进行4 次平行试验，实际测得辣木多酚的提取率为3.20%±0.02%.预测值与实际理论值接近，模型预测值在实际值的误差范围之内.说明采用响应面法优化得到的辣木多酚的工艺条件参数具一定的可靠性.

2.6 体外抗氧化活性评价 由表4可知，辣木叶多酚的ORAC值高达8296±76 μmol TE·g-1，且具有清除OH·、DPPH·和ABTS·+的能力，且清除OH·的半数清除浓度（IC50）值小于维生素C（VC）的值，清除DPPH·的IC50值与VC的值无显著性差异，即辣木叶多酚清除OH·和DPPH·的效果分别优于或接近VC的效果.

表4 辣木叶多酚的体外抗氧化能力评价Tab. 4 Evaluation of antioxidant activity in vitro of polyphenols from leaves of M. oleifera

3 讨论与结论

利用超声波辅助正丙醇-硫酸铵双水相法提取辣木叶多酚，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 设计-响应面法（RSM）优化辣木叶多酚提取的最佳工艺参数为：硫酸铵用量0.3 g·mL-1，正丙醇体积分数78%，液料比52.5∶1（V·m-1，mL·g-1），超声时间50 min，超声温度51 °C.数学回归模型为：Y=2.840+0.062A+0.130B+0.140C-0.067D-0.045AC-0.055AD+0.180BC-0.160BD+0.047CD-0.410A2-0.390B2-0.420C2-0.760D2.在此工艺下，辣木叶多酚提取率为3.20%±0.02%.裴斐等［24]采用超声波辅助蒸馏水法提取辣木叶多酚，而符稳群等［25]采用超声波辅助乙醇法提取，获得多酚提取率分别为2.514%和2.732%.本研究中获得的提取率比上述二种方法的提取率分别高出0.686%和0.468%，因此采用双水相法提取辣木叶多酚会显著提高其提取率.

抗氧化效果的体外化学评价通常采用的指标包括ORAC法、OH·清除法、ABTS·+清除法、DPPH·清除法、超氧阴离子（O2·-）清除法和铁离子还原能力（FRAP）法等多种方法.不同物质的化学与生物学性质差异很大，不同体外测定方法的原理不同，同一种物质清除各种自由基的能力不同；即使同一种物质采用不同的评价方法结果也不同，因此在评价一种物质的抗氧化效果时通常采用多种方法进行综合评价.ORAC法是基于物质供氢能力的一种测定方法，与人类生物学相关性最大，所得到的抗氧化能力更能反映物质在体内的相关作用，目前普遍应用于对各种物质的抗氧化评价［36].本研究中不仅辣木叶多酚的ORAC 值高达8296±76 μmol TE·g-1，且其清除OH·、DPPH·的效果分别均优于或接近VC的效果，该结果显著高于裴斐等［24]提取的辣木叶多酚清除OH·、DPPH·的效果，这应该与双水相法能起到纯化的作用有关.

综上所述，通过超声波辅助双水相法提取的辣木叶多酚已经具有较强的体外抗氧化活性，是一种良好的天然抗氧化剂.但针对辣木叶多酚分离纯化、体内活性测定及活性机理还需进一步研究.