动物肝纤维化模型建立研究进展*

艾丁丁，罗伟生 ,蒋云霞

广西中医药大学( 南宁530000)

慢性肝病是指发生在肝脏的病变过程，主要是指肝细胞的损伤和修复的循环过程，一般是指从肝炎到肝癌的过程，其中间环节为肝纤维化，而肝纤维化的核心机制在于肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化和凋亡[1],HSC的过量活化使得辅助生成胶原细胞和基底外细胞的物质大量形成,从而加速了肝纤维化的进程，使得肝纤维化向着肝硬化等不可逆的方向发展。而非酒精性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是慢性肝病发病的重要影响因素[2]，其中发生炎症性病变的脂肪组织称为“毒脂”对发展至肝炎之后肝纤维化病理过程中肝细胞的损伤和修复大有影响。目前，制作肝纤维化模型可效仿肝硬化模型的分类方法，但需针对目前肝纤维化病变以非酒精性原因增多为主进行针对性造模。近年来，许多学者主力制作标准的肝纤维化模型，多使用大鼠、小鼠或家兔，但本着动物造模应与人类的病变基本相似、肝纤维化分期过程明显、造模的可重复性和简便性等特点，故多使用大鼠进行肝纤维化造模[3]。

1 化学性损伤肝纤维化模型

化学性肝纤维化是由能造成肝毒性的化学物质所引起的肝细胞损伤和修复交替出现导致肝内结缔组织异常增生的直接结果。造模所使用的常用药物试剂为四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)、二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)等物质，这类物质具有强烈的肝损害性，能够在不同程度破坏肝脏细胞导致肝内结缔组织异常增生。

1.1 四氯化碳诱导肝纤维化动物模型 四氯化碳(CCl4)是一种无色有机溶剂，对任何油脂具有极强的溶解性，尤其是动物油脂，因此，在人体表现为强肝毒性。CCl4通过和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可诱导肝细胞中的micro RNA基因，可导致肝细胞的损伤和再修复，出现肝纤维化[4]。CCl4作用于肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发展的基础，HSC激活和转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞迅速增殖发展为肝纤维化[5]，而肌成纤维细胞短时间内成倍堆积严重可致肝硬化甚至肝癌。此种病变的发展过程与人类慢性药物性肝病的发展过程类似，因此，CCl4可用于探索药物性肝纤维化的发病机理和评价抗肝纤维化药物的临床疗效等实验研究。CCl4诱导肝纤维化主要是影响体内的酶学变化和炎症因子,从而改变了肝细胞损伤及再修复的过程[6]，且具有经济实惠、可靠性和可重复性较高等优势，成为了目前广泛应用的肝纤维化动物造模方法的最佳体外试剂。但由于此单一造模方法成模率低，死亡率高[7]，所以现今多采用复合试剂或联合方式造模。

1.2 二甲基亚硝胺诱导肝纤维化动物模型 DMN是一种世界公认的致癌有机化合物中间体成分，具有肝毒性、肾毒性和基因毒性等，其代谢后产物对肝脏细胞损伤较大，且易加速其纤维化速度，若不及时中止肝纤维化的过程，最终则形成肝细胞坏死致肝硬化。有Cheng等[8]研究人员用80%DMN(以生理盐水稀释)和SPF级大鼠，以0.5 ml/kg和2 ml/kg分为两组模型组和一组空白对照组，每周进行两次腹腔注射造模，在适应性喂养一周后开始造模，注射至第四周模型初步形成，到实验结束时模型组总共存活27只，且无论高剂量组还是低剂量组肝脏重量均有增加。用上述方法制造的肝纤维化模型，肝组织主要出现肝门脉窦性狭窄、肝门周围血管扩张、肝假小叶形成和肝细胞炎症症状等，还有部分可见明显的胶原纤维增生，最终形成肝纤维化，甚至严重者可出现肝硬化。DMN诱导的肝纤维化动物模型，其致肝纤维化的机制一般为炎症反应和胶原蛋白的增生和沉积，近年还发现与脂肪代谢的异常相关[9]，而脂肪代谢异常还是非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的重要发生机制，故DMN也常用于肝炎和肝硬化的动物造模。但是DMN具有较强的肝毒性，且为日常重要的致癌物质之一，因此近年被国家明令列为管制药物，即便是用于实验动物造模也需获得批准才能申购，因此，DMN近年来由于管制限制和毒性难以把握，才逐渐退出了一线肝病造模用药行列。

2 酒精性肝纤维化动物模型

酒精性肝病(ALD)是指主要是受酒精损害较大使肝脏细胞出现脂肪的堆积、纤维化形成并逐步向肝硬化发展，如若在肝硬化之前不及时逆转，则最终导致肝细胞不可逆死亡，还可发展为肝癌。因此，利用已知的肝病临床症状，在与人体有相似机制的动物身上建模，研究其发病机制和病因，对现代肝病的分型和治疗具有极大的意义。现代实验研究，以急性酒精性肝纤维化动物造模和慢性酒精性肝纤维化动物造模，均多以小鼠造模为主，并且以急性酒精灌胃法造模较优[10]，此种造模方法能在短时间内使肝内细胞出现炎症反应，引起肝血清酶ALT和AST的轻度升高，从而出现肝纤维化的病变，从而，也能有效的把动物模型控制在肝病可逆性强的肝纤维化的阶段。而慢性酒精性肝纤维化小鼠造模因违反了动物天生厌恶酒精的天性，所以成模率低。也有研究表明，ALD动物模型主要只涉及轻度肝损伤(即脂肪变性和轻中度炎症)而人类严重的酒精性肝炎往往发生在肝硬化环境中，甚至更严重者可发展至肝衰竭而导致死亡[11],因此，在现实中的酒精性肝纤维化动物造模，往往需要运用大鼠在慢性酒精性肝纤维化的基础上，造成急性酒精性肝损伤，从而模拟现实人类复杂的肝病发生环境进行同等条件下模拟造模，但由于其操作程序的复杂性，造模成功率也较低，此方法也难于在实验室环境下应用。

3 非酒精性肝病(NAFLD)

是指排除酒精和另外确切的肝脏损害病因所形成的肝脏细胞的损伤，其病理特点为肝内脂肪的大量堆积，从而导致肌纤维的过度增殖加剧肝纤维化的形成。近年来，学界认为NAFLD出现的肝细胞内脂肪过度沉积的现象还与胰岛素抵抗相关[12]；也有研究表明，我国成人患NAFLD的患病率在某些地区有逐年增加的趋势[13]，并且极易迁延他病。其主要的致病因素有胰岛素抵抗、“二次打击”学说[14]、免疫功能紊乱、慢性发展的炎症性损伤、肝脏Kupffer细胞介导的促炎症及加速脂质沉积作用等。因此，有必要建造真实、可靠的非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型，对此疾病的机制和病理过程进行研究。

3.1 血吸虫肝纤维化动物模型 血吸虫病是一种危害人体健康并且能引起肝细胞的损伤的人兽共患疾病[15]，血吸虫卵在体内能不断的刺激机体的免疫细胞并促使大量肝星状细胞(HSC)聚积，形成以虫卵为中心的炎性肉芽肿，其肉芽肿外周包裹着由肌成纤维细胞和胶原纤维异常增生的纤维，最终形成肝纤维化。但是，血吸虫卵内分泌物刺激HSC具有两面性，能同时激活HSC启动肝纤维化程序，也能诱导HSC凋亡从而抑制肝纤维化[16]。因此，研究制作血吸虫肝纤维化动物模型其重点在于认清血吸虫卵内如何启动和抑制HSC细胞的机制。孔庆明等[17]运用小鼠经腹部剃毛贴片感染血吸虫尾蚴建立肝纤维化动物模型，16周后应用HE染色和马森染色评估肝脏纤维化程度证明造模成功，肝脏中虫卵附着的肉芽肿较大。也有实验研究发现，通过对脾脏质量指数的评估比肝脏质量指数更能反应肝纤维化的程度。但是此方法造模周期长，且血吸虫为人兽共患感染物，对实验人员及实验室操作要求较高。目前，对血吸虫性肝纤维化的造模最佳动物为小鼠，但如果采用年龄较小的小鼠容易造成在造模前期就出现批量死亡，从而影响实验成模率，因此，此造模方式仅用于实验室研究抗血吸虫药物的开发和血吸虫影响肝纤维化机制的小范围实验。

3.2 高脂类肝纤维化动物模型 高脂类肝纤维化是指主要由于营养失调性引起的非酒精性脂肪性肝病，患者由于饮食习惯和生活方式的改变而长期摄入过量的含脂肪类物质，从而导致肝脏脂肪过度沉积改变肝脏内肝细胞的构造形成肝纤维化。由于现代人物质生活越来越好，摄入过多的脂肪、糖类等物质的机率逐渐增加，所以，建立高脂类肝纤维化动物模型用于研究人类脂肪性肝病有着极为相通的病变基础。高脂类肝纤维化动物模型的建造一般采用雄性SPF级小鼠，体重在20 g左右为宜[18]，也可采用家兔造模。一为配方合成高脂饲料造模：配方常以饲料为基本营养来源所占比例约为80%，再加入10%～15%油类物质如调和油、1.5%胆固醇和0.5%胆盐及微量元素等，造模6周后取小鼠血清，检验肝功能、甘油三酯和总胆固醇等指标验证造模结果，若出现肝组织内弥漫性分变脂肪滴分布全肝，可视为造模成功。二为配方元素缺乏高脂饲料造模：一般采用60%～80%的高脂胆碱缺乏饲料，先适应性喂养，随后分别在第4周、8周、16周随机处死5只小鼠验证造模结果，一般于第6周开始出现肝纤维化[19]。此种造模方式简单易行，可重复性强，其动物模型与人体内肝脏的内环境病变及其相似，可有效的进行高脂类肝纤维化肝病的病理机制和用药研究。

4 复合型损伤肝纤维化模型

随着社会生活水平的发展，现代人的生活具有一定的复杂性，从而导致肝病的因素复杂多变，甚至是多种复合性因素共同影响肝病的形成和发展，尤其是肝纤维化是肝病的转归发展的中心环节。因此，建立复合型损伤的肝纤维化动物模型极具临床必要性和符合肝病流行病学发展的需求。建立复合型肝纤维化模型采用乙醇灌胃、高脂饲料喂养、高糖饮水等复合因素，并结合腹腔注射CCl4的改良版联合方法造模。采用标准SD级大鼠，体重在200 g左右，在适应性喂养1周之后用此方法分组造模8周，在第4周和第8周分组随机抓取5只大鼠取标本进行病理学、肝功能指标检测，第8周后模型组、对照组大鼠均形成肝纤维化。此种造模方法的优点是可以在短时间内建立可重复性高、稳定性强的肝纤维化模型。同时，在一定程度上解决了单一因素的动物模型与现代临床患者病情有差距的问题，复合型肝纤维化动物模型的成模率高，动物在造模期间的病死率较低。

5 小结与展望

简单来说，建立动物模型的对研究人类疾病有着很好的帮助，能使我更好的研究肝纤维化的机制和进行新药抗纤维化的开发研究。但是，由于动物本身和人体系统还是具有一定的生物学，导致动物模型也不能完全代替人体用来进行更精确的病程研究。近来，有数据表明，人体机体的老化也会影响慢性肝病，特别是对慢性肝病晚期的血液循环和肝纤维化产生影响[20]。然而，我们目前较为成熟和广泛应用的肝纤维化动物模型绝大部分是使用成年的或幼年的小鼠、大鼠或家兔进行基础建模，此种方法下建立的肝纤维化模型是否能有效研究老年化肝纤维化病变的发展仍未可知。

综上所述，目前仍然没有一种肝纤维化模型能够完整体现人类肝纤维化的病程发展特点。然而，动物模型能够帮助我们研究疾病的病因和病理特性，提出新的病因假说和治疗方法。随着现代对建模方式的不断改良，有望建立客观、可控性强和可重复性高的肝纤维化动物模型，能更好的研究肝纤维化的发病机制，寻求更好的逆转纤维化进程的药物，从而及时截断肝纤维化向肝硬化甚至慢性肝病的终末病程发展的大趋势。